C242T基因多态性与大动脉粥样硬化型脑梗死的相关性研究*

于芳苹，蒋 萍，赵迎春△，李丽敏，杨永益

(上海交通大学附属第一人民医院松江分院：1.老年干部科；2.神经内科,上海 201600)

脑梗死是神经科常见的急、危、重症之一，具有很高的致残率和病死率[1]，颅内外大动脉粥样硬化是脑梗死最主要的原因之一。高血压、糖尿病、血脂代谢异常和吸烟均是大动脉粥样硬化型脑梗死(large artery atherosclerotic cerebral infarction,LAACI)的常见危险因素。近年来，大量研究发现还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶p22phox亚基C242T基因多态性也与LAACI密切相关[2]。该基因C242T多态性可致第72位组氨酸被酪氨酸取代，改变了NADPH氧化酶的活性，导致活性氧增加、血管壁自由基代谢紊乱[3]；过多的活性氧可促进动脉粥样硬化斑块内平滑肌细胞的增殖，低密度脂蛋白氧化，加速动脉粥样斑块形成[4-5]。但也有研究认为，该基因多态性与脑梗死无显著相关性，究其原因可能与人种、地域差异，以及研究方法不同有关。本课题组前期研究结果提示C242T基因多态性与未按病因分型、分组的全因脑梗死有一定的相关性，但与高血压、糖尿病、饮酒和吸烟等传统危险因素相比，C242T基因多态性对全因脑梗死的影响并不显著[6]。本研究旨在通过检测本院LAACI患者的NADPH氧化酶活性、基因型等，探讨C242T基因多态性与LAACI之间有无相关性，以及它们之间的相关性强度，从而为LAACI的病因及基因治疗途径提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2014年12月至2015年12月在本院神经内科住院的LAACI患者310例(LAACI组)，其中男171例，女139例，平均年龄(66.67±11.91)岁。纳入标准：头颅CT和(或)磁共振成像(MRI)明确诊断；符合1996年第4届全国脑血管病会议修订的诊断标准。排除标准：最近有颅脑损伤、肿瘤、手术、创伤、自身免疫性疾病及严重心、肺、肾等疾病；有严重肝肾疾病、血液病及自身免疫性疾病。另选择同期本院体检中心健康体检人员330例(对照组)，其中男179例，女151例，平均年龄(65.76±10.25)岁，与LAACI患者无血缘关系，无脑梗死家族史。所有研究对象均为上海松江地区汉族人群。高血压病的诊断标准为血压(BP)≥140/90 mm Hg或正在服用降压药物；糖尿病的标准为空腹血糖大于或等于7.0 mmol/L或已服用降血糖药物治疗；吸烟的标准为正在吸烟或有吸烟史。本研究为病例对照研究，已获得医院伦理委员会批准，全部受试者均知情同意。

1.2方法

1.2.1临床资料采集 所有研究对象进行临床资料采集，分别记录性别、年龄、血糖、血压、饮酒史、吸烟史、高血压史；总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及脂蛋白a[Lp(a)]水平。

1.2.2NADPH氧化酶活性测定 采集入院患者次日清晨空腹肘静脉血2 mL，采用密度梯度离心法对新鲜血提取单个核白细胞。采用细胞NADPH氧化酶活性光度法定量检测酶活性(NADPH氧化酶活性光度法定量检测试剂盒，美国Genmed公司)。步骤严格按照说明书进行。

1.2.3检测指标 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(武汉Cusabio公司)测定所有受试者血浆氧化高密度脂蛋白(ox-HDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)及丙二醛(MDA)水平。采用ELISA试剂盒(瑞典Mercodia公司)测定所有受试者血浆氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)水平。严格按照试剂盒说明书进行检测。

1.2.4联合聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP) 采用美国OMEGA公司生产的基因提取试剂盒，提取所有实验者红细胞中的基因组DNA，置于-80 ℃冰箱保存备用。引物序列(由上海生工生物工程股份有限公司合成)：上游5′-TGCTTGTGGGTAAACCAAGGCCGGTG-3′，下游5′-AACACTGAGGTAAGTGGGGGTGGCTCCTGT-3′。PCR反应体系50 μL：模板DNA 15 μL，引物2 μL，2×PCR反应混合物25 μL，双蒸水8 μL。PCR反应条件：预变性95.0 ℃ 3 min，变性95.0 ℃ 30 s，退火65.5 ℃ 30 s，延伸72.0 ℃ 45 s，共30个循环；末次延伸：72.0 ℃ 10 min，反应管冷却至4.0 ℃。15 μL PCR产物加3 μL上样缓冲液，在2%琼脂糖凝胶上电泳30 min， Bio-Rad凝胶成像系统观察。取PCR产物10 μL，利用RsaⅠ限制性内切酶酶切，酶切反应体系共20 μL，37.0 ℃恒温孵育16 h，取15 μL酶切产物加3 μL上样缓冲液。酶切产物在2%琼脂糖凝胶上电泳30 min，Bio-Rad凝胶成像系统检测电泳结果，分析基因型。

1.2.5基因测序 对PCR产物进行核苷酸序列测序进一步验证，由上海生工生物工程股份有限公司完成。

2 结 果

2.1两组一般临床资料、血脂水平、NADPH氧化酶活性比较 LAACI组与对照组的年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05)。LAACI组MDA水平、NADPH氧化酶活性明显高于对照组(P<0.05)；吸烟率、饮酒率、高血压率、收缩压、舒张压，以及血糖、TC、TG、LDL-C、ox-HDL、ox-LDL水平在LAACI组均比对照组高(P<0.05)，HDL-C水平比对照组低(P<0.05)，见表1。

表1 两组基本临床资料、血脂水平、NADPH氧化酶活性比较

M:Marker;1～4:PCR产物

图1 NADPH氧化酶p22phox亚基C242T基因PCR扩增产物电泳结果

M:Marker;1、2、4、5、6:CC基因型；3:TT基因型；7:CT基因型

图2 NADPH氧化酶p22phox亚基C242T基因酶切产物电泳结果

2.2NADPH 氧化酶p22phox亚基C242T基因PCR-RFLP 结果 NADPH 氧化酶p22phox亚基C242T基因PCR扩增产物在Bio-Rad凝胶成像系统可见长度为353 bp的条带(图1)，通过限制性内切酶RsaⅠ酶切后电泳，在凝胶成像系统可见3种不同条带：纯合子(CC)基因型为长度353 bp的单条带；杂合子(CT)基因型为3条条带：353、193、160 bp；纯合子(TT)基因型为2条条带：160、193 bp(图2)。对PCR产物进行DNA碱基测序，测序结果与酶切结果一致，见图3。

A:CT基因型；B：CC基因型；C：TT基因型。箭头显示处即为基因多态性位点，纯合型为多态性位点处出现单条测序峰，杂合型则出现两条测序峰。红色峰：T;绿色峰：A;黑色峰：G;蓝色峰：C

图3 NADPH氧化酶p22phox亚基C242T基因碱基测序图

2.3两组基因型及基因频率比较 LAACI组CT+TT基因型频率、T等位基因频率明显高于对照组(P<0.05)，见表2。

2.4LAACI危险因素二分类Logistic回归分析 对采集的多项基本临床资料及实验室检测结果进行二分类Logistic回归分析发现，吸烟、血糖、高血压、收缩压、舒张压、Lp(a)、ox-HDL水平、MDA水平、NADPH氧化酶活性、基因型是LAACI的独立危险因素，见表3。

表2 LAACI组和对照组基因型频率及等位基因频率比较

表3 LAACI危险因素Logistic回归分析结果

3 讨 论

NADPH氧化酶不仅是体内重要的氧化还原酶来催化体内的氧化还原反应，也是体内活性氧的重要来源。p22phox亚基是血管NADPH氧化酶的重要组成部分，由CYBA (cytochrome b245 alpha) 基因编码。研究显示，C242T基因多态性对NADPH氧化酶活性改变的影响较大，与高血压、颈动脉粥样硬化、脑梗死等多种疾病相关。国外学者认为，NADPH氧化酶p22phox亚基C242T基因T等位基因的突变会增加脑梗死的发病风险，在脑梗死患者CT+TT基因型频率明显高于正常对照；且在LAACI患者中频率最高[7-8]。研究还发现，C242T基因多态性与脑梗死之间不仅存在显著的相关性，而且具有明显的种族差异，欧洲人种较亚洲人种更为显著[9]。国内学者张晨等[10]对青岛地区人群的研究显示，C242T基因多态性可能是颈动脉粥样硬化的危险因素之一。本课题组针对上海松江地区汉族人群NADPH氧化酶p22phox亚基C242T基因多态性与LAACI相关性进行研究，发现LAACI患者CT+TT基因型频率及T等位基因频率明显高于对照组，与以往的研究结果一致。但也有学者报道C242T基因多态性与脑梗死无关[11]，可能与研究人群种族差异、研究方法、研究者的认识水平及样本量大小等因素相关。

2012年一项纳入6个关于C242T基因多态性与脑梗死相关性研究(包括1 948例缺血性脑血管病患者和2 357例健康对照者)的Meta分析显示，C242T基因多态性与全因缺血性脑梗死无相关性，但与LAACI具有显著相关性[12]。本研究组前期的研究也显示C242T基因多态性与未按病因分型、分组的全因脑梗死无显著的相关性[6]。但在本研究中发现，p22phox亚基C242T基因发生突变是LAACI的一个独立危险因素。

研究证实，动脉粥样硬化与血脂代谢异常密切相关，LDL、HDL经氧化修饰成ox-LDL和ox-HDL后可进一步使致动脉粥样硬化效应增强，加速动脉粥样硬化斑块形成、进展，导致动脉粥样硬化性心脑血管疾病发生[13-15]。研究还发现，NADPH氧化酶是中性粒细胞和血管系统中活性氧的主要来源，活性氧通过诱导血管内皮炎性反应，影响脂质蛋白氧化、平滑肌细胞增生，使动脉粥样硬化斑块形成[16-17]。C242T基因多态性影响了NADPH氧化酶的活性，通过改变血管系统中氧化还原状态，升高了血清氧化脂蛋白水平，促进动脉粥样硬化及斑块形成，同时也导致体内脂质过氧化产物MDA水平升高[18-19]。本研究也发现LAACI患者的TG、TC水平高于对照组，而HDL水平低于对照组。另外，LAACI患者的脂蛋白氧化水平明显高于对照组，具有更高的ox-HDL及MDA水平。揭示C242T基因多态性可能通过脂蛋白氧化修饰参与了大动脉粥样硬化斑块的形成及进展，与LAACI发病密切相关。

综上所述，NADPH氧化酶亚基p22Phox C242T基因多态性与LAACI的发生相关。推测C242T基因多态性可能通过改变NADPH氧化酶的活性，影响脂蛋白氧化修饰，参与了动脉粥样硬化斑块的发生和进展，是LAACI的发病机制之一。因此，降低NADPH氧化酶的活性，抑制脂质氧化，减轻动脉粥样斑块内的氧化应激甚至基因治疗等每一环节将来均有可能成为LAACI患者治疗和预防潜在的药物靶点和技术手段[20]，这仍需进一步研究证实。

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