ZBTB20在SLE患者外周血B细胞中的表达和临床意义*

裴 露，王婷婷，朱 峰，胡文坛，刘红春△

(1.河南中医药大学第二附属医院检验科，郑州 450002；2.郑州大学第一附属医院检验科，郑州 450003)

系统性红斑狼疮(SLE)是一种因B细胞异常活化，T细胞激活机制异常，机体对免疫复合物清除障碍并累及全身多器官多系统的慢性自身免疫性疾病[1-2]。目前SLE的发病机制尚不明确,一般认为其机制是由遗传、自身免疫等诸多因素共同作用，使机体免疫系统功能发生紊乱而引起机体发病。有研究表明SLE中由B细胞异常分化的浆细胞对自身抗原具有特异性和高亲和力，并且可以产生大量的抗体而导致SLE的发病[3-4]。锌指和BTB结构域蛋白20(ZBTB20),也称为HOF、DPZF和Zfp288，与Bcl6同源，是一种广泛的锌指复合体[5]。同时ZBTB20也参与细胞功能，包括细胞转录、增殖及肿瘤的发生[6-7]。近年有研究表明，ZBTB20是淋巴细胞分化重要的转录因子，通过调控免疫细胞相关增殖、分化通路参与到免疫反应中，可诱导异常的体液免疫反应，尤其是B细胞过度活化引起的自身免疫性疾病的发病。ZBTB20依赖干扰素调节因子-4(IRF4)启动B细胞分化为浆细胞，促进其生发中心反应，维持浆细胞的寿命并且分泌免疫球蛋白[8]。因此，ZBTB20在SLE的发病机制中起了至关重要的作用，与B细胞过度活化分化为浆细胞并且持续分泌自身抗体相关。该研究主要通过检测ZBTB20在SLE外周血CD19+B细胞中的表达及与浆细胞的相关性，初步探讨ZBTB20与SLE发病的相关性及可能参与的发病机制。

1 资料与方法

1.1一般资料

1.1.1研究对象 从郑州大学第一附属医院风湿免疫科2016年8月至2017年2月的住院患者中选取36例初次确诊SLE的患者为SLE组，其中男2例，女34例，年龄19～48岁，平均(31±7)岁。患者均符合2009年美国风湿病学会(ACR)制订的SLE诊断标准，排除患有感染，肿瘤及其他自身免疫性疾病的患者。对照组为30例健康体检者，其中男4例，女26例，年龄24～50岁，平均(35±6)岁。两组在性别及年龄方面的差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有对象签署知情同意书，研究经本院伦理委员会批准。

1.1.2试剂与材料 人外周血淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限公司)；磁珠分选柱、CD19磁珠(德国美天旎公司)；FITC标记的抗人CD138抗体(美国BD公司，批号：347193，1∶100稀释)；PerCPCY5.5标记的鼠抗人CD19抗体(美国eBioscience公司)；TRIzol试剂和反转录试剂盒(日本Takara公司)；PCR试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)；PCR引物(上海生工生物工程有限公司)，ZBTB20引物上游序列：5′-CCGCAGACAAACCAGCTAGA-3′，下游序列：5′-AAGGCTGTTGTAGGACGCTC-3′。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物上游序列：5′-AGAAGGCTGGGCTCATTTG-3′，下游序列：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。

1.2方法

1.2.1分离外周血单个核细胞(PBMCs) 清晨空腹抽取SLE组及对照组肘静脉血10 mL，经乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，保存于4 ℃，采集后2 h内处理标本，用Ficoll梯度密度离心法分离PBMCs，分别用于磁珠分选提取CD19+B 细胞和流式细胞检测B细胞亚群。

1.2.2RT-PCR检测ZBTB20的表达 TRIZOL法提取磁珠分选的CD19+B细胞总RNA，Oligo-dT逆转录为cDNA,之后冻存于-80 ℃冰箱以备用。管家基因GAPDH为内参，之后放入PCR仪中进行扩增。反应条件为95 ℃预变性10 min，进行1个循环；变性95 ℃ 10 s，60 ℃退火延伸45 s，40个循环；65～95 ℃绘制溶解曲线。采用双标准曲线法计算基因相对表达量。

1.2.3Western blot分析外周血ZBTB20蛋白水平 用红细胞裂解液提取PMBCs,然后提取细胞总蛋白，检测外周血ZBTB20蛋白的表达。

1.2.4荧光标记人外周血PBMC及流式细胞术检测 用400 μL磷酸盐缓冲液(PBS)重悬PBMCs，设置空白对照、CD19-PerCPCY5.5 2 μL单标、CD138-FITC 4 μL和CD138-FITC 4 μL+CD19-PerCPCY5.5 2 μL双标样本管，轻轻混匀后，置4 ℃避光孵育30 min；各管加入2 mL PBS后混匀；1 000 r/min，4 ℃,离心5 min，弃上清液；重复加入PBS 2 mL混匀，再以1 000 r/min，4 ℃,离心5 min；各个管中加固定液200 μL，混匀后，4 ℃避光1～2 h后上机检测。使用美国BD公司的FACS calibur流式细胞仪检测各管CD19-CD138+浆细胞/CD19+B细胞比例，FlowJo软件进行分析。

2 结 果

2.1外周血CD19+B细胞ZBTB20 mRNA和外周血ZBTB20蛋白表达 SLE组ZBTB20 mRNA的表达水平(0.527±0.181)明显高于对照组(0.246±0.145)，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1A。SLE组ZBTB20 蛋白的表达水平高于对照组(P<0.05)，见图1B。

2.2SLE组B细胞亚群的比例 与对照组比，SLE组CD19+B细胞比例降低，CD19-CD138+浆细胞比例及CD19-CD138+浆细胞/CD19+B细胞比值明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1、图2。

2.3CD19+B细胞中ZBTB20 mRNA表达水平与B细胞亚群的相关性分析 SLE患者中ZBTB20 mRNA表达水平与CD19-CD138+浆细胞比例呈明显正相关(r=0.165，P=0.028)，与CD19-CD138+浆细胞/CD19+B细胞的比值也呈正相关(r=0.225，P=0.021)；与对照组无相关性(r=-1.45，P=0.32)，见图3。

A:两组外周血CD19+B细胞中ZBTB20 mRNA表达，B：两组ZBTB20蛋白水平

图1 两组ZBTB20表达水平表1 SLE组B淋巴细胞亚群之间的比较[M(P25,P75)]

图2 SLE组和对照组外周血B细胞比例(A)、浆细胞比例(B)、浆细胞/B细胞(C)比值

图3 ZBTB20 mRNA与CD19-CD138+浆细胞/ CD19+B细胞比值的相关性分析

2.4SLE组ZBTB20mRNA表达与临床指标的相关性 SLE组ZBTB20 mRNA的表达与SLE活动期指标均呈明显正相关(P<0.05)，见表2。

3 讨 论

ZBTB20最早是在人树突状细胞中发现的锌指蛋白家族的新成员，因具有BTB/POZ结构域和5个C2H2锌指结构域得名[9]。近年来，有研究发现ZBTB20可通过调控免疫细胞从而参与机体的免疫反应，参与调控的关键就是可以促进B细胞分化为浆细胞，维持一部分浆细胞的寿命并分泌抗体，在这个调控过程中可能是由于存在IRF4-ZBTB20-Blimp1调节通路从而发挥了重要的作用[10]。韩国研究者LEE等[11]对1 596例SLE患者和2 640例健康者进行了全基因组关联性研究，从中筛选出16个SLE新易感基因，ZBTB20就是其中之一。ELMANN等[12]通过对SLE模型鼠脾细胞提取总的RNA进行检测，患病小鼠ZBTB20 mRNA的表达与未患病小鼠相比上调 1.9倍，RT-PCR实验进一步证实了微阵列的实验结果。ELMANN认为，ZBTB20 mRNA表达明显增加，可能与促进肾组织形成免疫复合物沉淀有关。上述研究结果提示ZBTB20在SLE发病机制中可能起到了关键作用。本研究结果显示，SLE组患者外周血B细胞中ZBTB20 mRNA的表达明显高于对照组,提示ZBTB20可能参与SLE发病。

ZBTB20在多种免疫细胞中表达，包括树突状细胞、单核细胞、淋巴细胞等，参与机体获得性免疫和固有免疫[13]。ZBTB20通过正向调控Toll样受体(TLR)，介导核因子kappa B(NF-κB)激活，参与固有免疫反应[14-15]。ZBTB20在生发中心成熟的B细胞中表达，随B细胞分化成熟ZBTB20的表达也逐渐增加，然后依赖干扰素调节因子4(IRF-4)促进B细胞分化为浆细胞,同时也与B细胞分化的关键转录因子B淋巴细胞成熟蛋白1(Blimp-1)存在着某种调节作用。本研究显示，SLE患者外周血CD19+B细胞比例明显降低，表明B细胞过度激活分化为浆细胞是SLE发病最主要的免疫学特征之一。并且SLE患者ZBTB20 mRNA的表达与CD19-CD138+浆细胞比例、CD19-CD138+浆细胞/CD19+B细胞比值均呈正相关，说明ZBTB20可能通过参与B细胞异常分化而参与SLE发病机制。

综上所述，ZBTB20在SLE患者体内的表达水平增加，这与B细胞异常分化为浆细胞且分泌的自身抗体有关，提示ZBTB20可能通过调节B细胞异常分化参与到SLE发病机制中，这也为以后研究提供了新思路。

参考文献

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