蒲公英甾醇对氧化损伤心肌细胞保护作用研究*

王娓娓，张红苗，王 琳，鲍天昊，3△

(1.昆明医科大学第二附属医院心内科三病区，昆明 650101；2.昆明医科大学第二附属医院肝胆科，昆明 650101；3.云南省精神病医院老年科，昆明 650224)

缺血的心肌发生再灌注后，心肌的功能障碍和结构损伤不能立即恢复反而加重的现象称心肌缺血-再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIR)[1]。心肌细胞氧化应激损伤是MIR血运重建后的主要病理生理特征，因此保护损伤的心肌细胞，使其增加抵抗氧化损伤的能力对MIR治疗有着重要的意义[2]。然而，目前却缺少有效防止MIR所致心肌细胞氧化应激损伤的方法。蒲公英甾醇为蒲公英根中三萜类活性成分，已有报道蒲公英甾醇具有抗肿瘤，抗炎，抗氧化等多种药理学作用[3]，但对MIR的保护作用未完全清楚。本文就蒲公英甾醇对MIR发挥保护作用的部分机制进行研究，以期为心脏MIR损伤治疗策略的制订提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 酶标仪(美国Molecular Devices公司，FlexStation 3),RT-PCR仪(美国Applied Biosystems公司，7300型)，化学发光荧光成像系统(美国伯乐公司，ChemiDoc XRS)。小鼠心肌细胞(CSC)购自上海抚生实业有限公司。Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)高糖培养基(批号11965092)、DMEM培养基(批号11966025)、青/链霉素(P/S，批号15070063)、L-谷氨酰胺的衍生物(Glut MAX，批号35050061)、0.05%胰酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA，批号25300054)、胎牛血清(FBS，批号10099141)均购自美国Gibco公司。四甲基偶氮唑蓝(MTT，批号M2128)、碱性纤维生长因子(bFGF，批号GF003AF)、磷酸化细胞外信号调节的蛋白激酶1/2(p-ERK1/2，批号05-797R)、总细胞外信号调节的蛋白激酶1/2(t-ERK1/2，批号06-182)购自美国Millipore公司。PCR逆转录试剂盒(批号639505)购自宝生物工程有限公司。SYBRGreenMaster(批号4309155)购自美国ABI公司。丙二醛(MDA，批号MAK085)、超氧化物歧化酶(SOD，批号19160)试剂盒购自美国Sigma公司。蒲公英甾醇购自成都瑞芬思生物科技有限公司(批号127-22-0，纯度大于98%，每份20 mg)。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)及B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)基因引物由美国Invitrogen公司合成。GAPDH:F 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′;R 5′-TTGGCTCCACCCTTCAAGTG-3′。Caspase-3:F 5′-ACCGATGTCGATGCAGCTAA-3′;R 5′-GGTGCGGTAGAGTAAGCATA-3′。Bcl-2:F 5′-GCTGGGGATGACTTCTCTCGT-3′;R 5′-TGTGGCCCAGGTATGCAC-3′。

1.2方法

1.2.1模型制作 CSC细胞以2×105/孔的细胞浓度接种于6孔板，24 h后使用PBS清洗细胞，然后将不含葡萄糖和血清的DMEM培养基加入6孔板，在37 ℃，5%CO2，1%O2培养箱中培养2 h，然后更换为含有10%胎牛血清(FBS)和高葡萄糖(4 500 mg/L)的DMEM培养基在正常细胞培养箱中培养6 h。正常对照组CSC细胞始终用含有10% FBS的高糖DMEM培养基在正常细胞培养箱中培养。蒲公英甾醇治疗组于缺血-再灌注损伤(I/R)开始前6 h将蒲公英甾醇加入6孔板。实验分组如下：正常对照组、I/R组、蒲公英治疗组(蒲公英甾醇+I/R组)和阳性对照组(bFGF+I/R组)。蒲公英治疗浓度分别为5、10、30 μmol/L。bFGF对细胞增殖具有明确的促进作用[4]，在本研究中作为阳性对照，使用剂量为20 μg/L。

1.2.2MTT测定 CSC细胞以0.5×104/孔种于96孔板，每孔加入0.2 mL培养基并给予不同处理，体外培养48 h，加入5 mg/mL的MTT在37 ℃作用4 h，去除培养基，加入二甲基亚砜(DMSO) 150 μL/孔，室温下孵育10 min，使用酶标仪450 nm测定吸光度。细胞活力=(吸光度/溶剂空白对照组吸光度)×100%。

1.2.3RT-PCR测定 用于实验的细胞加入Trizol裂解液，提取总RNA。根据逆转录试剂盒说明书将总RNA逆转为cDNA。cDNA加入引物建立扩增体系后按RT-PCR试剂盒说明书进行扩增。

1.2.4生化法测定SOD、MDA的表达 CSC细胞去除培养液，用PBS洗涤2遍，每孔加入0.1 mol/L的PBS和0.05 mmol/L的EDTA(pH 8.0) 1 mL，再加入1%的Triton-X 100 50 μL，孵育1 min，加入25%的磷酸(H3PO4)100 μL，4 ℃离心1 h，取上清液，按说明书测定MDA、SOD水平。

1.2.5Western blot分析 CSC细胞加入RIPA裂解液提取总蛋白并测定蛋白浓度，以40 ng蛋白浓度进行上样。蛋白变性后在10%的分离胶上电泳。待溴酚蓝刚跑出胶，停止电泳。进行转膜、封闭后加入一抗p-ERK1/2(1∶2 000)，t-ERK1/2(1∶1 000)在4 ℃孵育过夜，次日洗去一抗,加入二抗孵育1 h。洗去二抗，电化学发光(ECL)显影。凝胶成像仪Image Lab拍照，Image J软件检测灰度值。

2 结 果

2.1CSC细胞活力 MTT测试发现，与正常对照组(0.651±0.085)比较，I/R组(0.418±0.059)细胞活力降低(P<0.05)，bFGF+I/R组(1.023±0.062)细胞活力明显增加(P<0.01)。各剂量蒲公英甾醇组细胞活力提高，其中30 μmol/L蒲公英甾醇(0.894±0.065)为最优选择(P<0.05)。

2.2CSC细胞Caspase-3 mRNA及Bcl-2 mRNA 与正常对照组相比，I/R组Caspase-3 mRNA表达增加(P<0.01)。与I/R组比较，各剂量蒲公英甾醇治疗均使CSC损伤模型Caspase-3 mRNA表达减少，10、30 μmol/L蒲公英甾醇组与I/R组比较差异有统计学意义(P<0.05)。与I/R组相比，bFGF+I/R组Caspase-3 mRNA表达减少(P<0.01)。与正常对照组相比，I/R组Bcl-2 mRNA表达减少(P<0.01)。与I/R组比较，各剂量蒲公英甾醇组Bcl-2 mRNA均表达回升，30 μmol/L蒲公英甾醇组与I/R组比较差异有统计学意义(P<0.05)。与I/R组相比，bFGF+I/R组Bcl-2 mRNA表达增加(P<0.05)，见表1。

表1 各组CSC细胞Caspase-3 mRNA及 Bcl-2 mRNA比较

a：P<0.01，与正常对照组比较；b：P<0.01，c：P<0.05，与I/R组比较

2.3CSC细胞MDA及SOD变化 与正常对照组相比，I/R组MDA水平提高(P<0.01)。与I/R组比较，bFGF+I/R组MDA水平降低(P<0.01)，各剂量蒲公英甾醇组MDA水平降低，其中10、30 μmol/L蒲公英甾醇组与I/R组比较差异有统计学意义(P<0.01)。与正常对照组相比，I/R组SOD水平降低(P<0.01)。与I/R组比较，bFGF+I/R组SOD水平增高(P<0.01)，各剂量蒲公英甾醇组SOD水平增高，30 μmol/L蒲公英甾醇组与I/R组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组CSC细胞MDA，SOD水平比较

a：P<0.01，与正常对照组比较；b：P<0.01，c：P<0.05，与I/R组比较

图1 不同研究组CSC细胞中ERK1/2蛋白表达水平

2.4氧化损伤CSC细胞ERK1/2表达 与正常对照组(1.020±0.098)相比，I/R组(0.647±0.087)p-ERK1/2与t-ERK1/2比值降低。与I/R组比较，30 μmol/L蒲公英甾醇组(0.894±0.092)p-ERK1/2与t-ERK1/2比值增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

3 讨 论

蒲公英是一种无毒且具有多种活性的天然药物，蒲公英甾醇是应用较为广泛的蒲公英提取物。已有报道表明蒲公英甾醇在动物模型中发挥抗炎作用[5]，可以通过调节Toll样受体4(TLR4)表达抑制氧化损伤导致的肺组织炎症[6]， 蒲公英甾醇通过抑制血管细胞黏附分子1(VCAM-1)和分化集落因子80(CD80)的表达对H2O2损伤的人脐静脉内皮细胞发挥抗凋亡等保护作用[7]。蒲公英甾醇通过调控ERK1/2和p38信号通路，抑制一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶-2(COX-2)表达对脂多糖损伤的巨噬细胞发挥保护作用[8]。本研究发现蒲公英甾醇通过激活ERK1/2信号途径对I/R的CSC细胞发挥保护作用。研究发现，I/R所致的氧化应激反应导致CSC细胞活力降低，凋亡基因Caspase-3 mRNA水平提高，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA水平降低。蒲公英甾醇治疗可以缓解I/R所致的CSC细胞氧化应激损伤，使细胞活力恢复，降低凋亡基因Caspase-3 mRNA水平，提高抗凋亡基因Bcl-2 mRNA水平。

I/R导致CSC细胞内氧自由基生成增多，脂质过氧化反应增强[9]。MDA是脂质过氧化反应的终末代谢产物，MDA水平可反应氧化损伤程度[10]。SOD能够清除代谢过程中的清除氧自由基，是体内抗氧化系统的重要组成部分[11]。因此降低MDA水平，提高SOD水平在CSC细胞I/R的治疗中具有积极意义[12]。本研究发现，I/R所致的氧化应激反应导致CSC细胞MDA水平提高，SOD水平降低，蒲公英甾醇治疗降低MDA水平，提高SOD水平，可以缓解I/R所致的CSC细胞氧化应激损伤，对CSC细胞具有积极的保护作用。

ERK是第1个被确定识别并克隆的MAPK基因，目前研究较多的是ERK1和ERK2，ERK1/2主要与细胞的生长发育、增殖、凋亡、分化、迁移等生物学行为有关[13-14]。ERK进入细胞核激活AP-1、ELk-1、SAP等引起相应生物学效应[15]。本研究发现，缺血-再灌注损伤所致的氧化应激反应导致CSC细胞p-ERK1/2与t-ERK1/2比值降低，蒲公英甾醇治疗使p-ERK1/2与t-ERK1/2比值增加，因此本研究认为蒲公英甾醇通过调控ERK1/2表达对I/R的CSC细胞发挥保护作用。

参考文献

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