左卡尼汀对感染性休克患者血小板及线粒体的影响

李力 汪峰

九江学院附属医院1重症医学科，2普外科（332000九江）

脓毒症导致对器官功能衰竭的发病机制尚不明确。有研究认为，感染所引起的全身炎症反应可抑制线粒体功能，导致组织器官没有足够的能量来维持正常的功能，机体处于低代谢状态甚至器官衰竭。然而从人体脏器获取线粒体很难实现。但是循环血液中的血小板线粒体含量丰富，甚至在危重患者中也容易获得。并且血小板线粒体功能可以用不同技术方法进行检测。也可作为线粒体靶向治疗药物效果的评估。本研究通过监测血小板水平以及血小板线粒体功能，来判断左卡尼汀注射液对脓毒症患者血小板的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2014年12月至2016年11月在我院ICU住院的脓毒症患者62例，其中男35例、女27例，年龄27～76岁。将患者随机分为两组，各31例，两组患者的性别、年龄无统计学意义，具有可比性。

1.2 诊断及纳入标准 所有患者均符合2014年《中国严重脓毒症/脓毒性休克治疗指南》关于脓毒症诊断标准，ICU住院时间超过7 d。排除标准：（1）既往有慢性器官功能损害患者，如慢性肾衰竭、肝硬化、慢性呼吸衰竭等；（2）恶性肿瘤患者；（3）自身免疫系统疾病患者；（4）确诊后7 d内自动出院或死亡患者；（5）存在明确药物过敏的患者；（6）用药剂量不足或疗程不足7 d、检测指标不全、及治疗期间输注血小板；（7）近2周用过影响血小板的药物，如阿司匹林、血宁片等等。

1.3 治疗方法 采用前瞻性开放式完全随机对照试验，将63例患者随机分为治疗组和对照组。对照组：参考《中国严重脓毒症/脓毒性休克治疗指南》采取常规集束化治疗方案。治疗组：在常规集束化治疗方案基础上，加用左卡尼汀注射液（常州兰陵制药有限公司生产）4 g加入生理盐水100 mL静脉滴注，每日1次，每次滴注时间约30 min，持续用药7 d。

1.4 样本处理 两组患者分别于治疗前及治疗第3、7 d留取新鲜静脉血样5 mL，干燥采血管中加入50 U/mL肝素抗凝处理。用生理盐水等倍稀释后，经Percoll（1.06 g/mL）密度梯度离心法（20℃，2 000 r/min，7 min）取F2白色絮状层，PBS冷冻洗涤3遍以上即得到分离纯化的血小板备用。

1.5 检测指标 血小板数量的检测：所有患者分别于入院时、入院后3、7 d抽取新鲜静脉血样送检验科检测血小板数值。血小板线粒体通透性转变孔（mitochondrial permeablity transition pore，mPTP）的检测：在细胞正常状态时，Calcein可进入线粒体内发出绿色强荧光，仅在细胞线粒体膜受损后，通透性转变孔开放的情况下，CoCl2可进入线粒体内淬灭该荧光。因此，该技术可用于判断细胞内线粒体通透性转变孔的开放程度，间接判断线粒体是否损伤。以Calcein⁃AM与CoCl2共同孵育血小板15 min，冷冻PBS洗涤后，采用流式细胞仪（BD FACS CotoⅡTM）进行定量检测，以细胞平均绿色荧光强度衡量线粒体通透性转变孔的状态。血小板线粒体跨膜电位（Mitochondrial membrane potential，MMP）检测：采用JC⁃1染色方法鉴定细胞内线粒体跨膜电位ΔΨm的变化。以JC⁃1孵育血小板15 min后，PBS冷冻洗涤，采用流式细胞仪进行定量检测，以绿色荧光（低ΔΨm细胞）所占百分比衡量血小板线粒体去极化的百分数。血小板线粒体内三磷酸腺苷（ATP）含量检测：以荧光素-荧光素酶法检测血小板线粒体ATP水平，血小板悬液（2×106/mL）与检测试剂等比混合，室温孵育15 min，采用Spectra Max M5酶标仪检测荧光强度（RLU）。

1.6 统计学方法 采用SPSS统计软件对数据进行统计学处理。计量资料用均数±标准差（±s）表示，分析比较两组数据间方差齐性，方差齐则组间比较采用等方差样本SNK检验，方差不齐则组间比较采用异方差样本Dunnetts′C检验，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血小板数量的比较 两组患者在入院时血小板数值差异无统计学意义，入院后3 d治疗组患者血小板数值仍低于入院时数值，而入院后7 d患者血小板数值高于入院时数值差异均有统计学意义（P＜0.05）；入院后3 d及入院后7 d治疗组患者血小板数值均显著高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 血小板数量比较Tab.1 Comparison of platelet count ±s

表1 血小板数量比较Tab.1 Comparison of platelet count ±s

注：与同组入院时比较，*P＜0.05；与对照组同日比较；#P＜0.05

组别对照组治疗组入院时78.42±2.34 78.34±3.40入院3 d 51.32±2.45 62.33±2.43*#入院7 d 64.52±5.36 91.41±4.23*#

2.2 两组血小板线粒体通透性转变孔的变化 两组患者在入院时Calcein值差异无统计学意义，入院后7 d患者Calcein值高于入院时，差异有统计学意义（P＜0.05）；入院后3 d及入院后7 d治疗组患者Calcein值均高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 血小板线粒体通透性转变孔变化比较Tab.2 Comparison of the changes of mPTP ±s

表2 血小板线粒体通透性转变孔变化比较Tab.2 Comparison of the changes of mPTP ±s

注：与同组入院时比较，*P＜0.05；与对照组同日比较；#P＜0.05

组别对照组治疗组入院时197.32±56.19 196.63±53.74入院3 d 165.53±42.13 185.12±51.82#入院7 d 187.34±35.41 234.24±40.67*#

2.3 两组血小板线粒体膜电位的变化 两组治疗前低线粒体膜电位细胞含量比较差异无统计学意义，入院后3 d及入院后7 d治疗组患者低线粒体膜电位细胞含量较治疗前降低（P＜0.05）；入院后3 d及入院后7 d治疗组患者低线粒体膜电位细胞含量均低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表3 血小板线粒体膜电位下降分布率比较Tab.3 Comparison of the decreasing distribution rate of MMP±s，%

表3 血小板线粒体膜电位下降分布率比较Tab.3 Comparison of the decreasing distribution rate of MMP±s，%

注：与同组入院时比较，*P＜0.05；与对照组同日比较；#P＜0.05

组别对照组治疗组入院时34.42±3.27 34.33±4.51入院3 d 37.01±5.13 32.33±2.12*#入院7 d 32.23±3.27 23.85±4.43*#

2.4 两组血小板线粒体内ATP水平的变化 两组治疗前血小板内ATP相对含量比较差异无统计学意义，入院后3 d及入院后7 d治疗组患者血小板内ATP水平均较治疗前均增高（P＜0.05），入院后3、7 d治疗组患者Calcein值均高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表4。

3 讨论

脓毒症是宿主对感染的反应失控导致危及生命的器官功能衰竭［1］。其主要特征是线粒体功能障碍，而线粒体功能降低在MODS的发生、发展及功能恢复中起关键性作用［2-3］。在脓毒症早期即出现线粒体对氧利用障碍［4］。随着脓毒症病情的进展，线粒体功能及数量均下降，为了适应线粒体能量供应，组织器官通过降低或关闭细胞功能来减少能量需求，从而形成一个新的供需平衡即器官功能障碍（MODS）［5］。如果严重脓毒症持续时间过长，线粒体结构和功能将呈现不可逆性的改变，最终导致线粒体功能衰竭，细胞能量枯竭，引起器官功能衰竭而死亡。

左卡尼汀即左旋肉碱是哺乳动物能量代谢中必需的体内天然物质。对线粒体功能的改善有重要作用：（1）左卡尼汀通过乙酰肉碱转移酶的活动，参与在脂酰肉碱和脂酰⁃CoA酯之间平衡的建立这对维持线粒体功能至关重要［6］；（2）左卡尼汀通过维持能量代谢相关酶以及氧化磷酸化的线粒体关键酶的活性稳定线粒体膜［7-8］，并改善受损线粒体超微结构、维持线粒体长度、减少线粒体损伤的数量，从而阻止细胞凋亡［9］；（3）左卡尼汀对于线粒体功能损伤的保护也有抗氧化和抗炎的机制参与［10-12］。在代谢应激时，线粒体积累脂酰⁃COA，是为了保持机体卡尼汀稳态。足够量的游离卡尼汀可促使堆积的脂酰⁃CoA进入线粒体内，使氧化磷酸化得以顺利进行。还能增加NADH细胞色素C还原酶、细胞色素氧化酶的活性、加速ATP的产生，从而提高组织细胞能量供应，阻止器官功能衰竭。

通过对在医院ICU 62例脓毒血症患者研究显示，加用左卡尼汀治疗的患者和常规治疗患者在入院时血小板数量差异无统计学意义，而入院后7 d，加用左卡尼汀治疗的患者血小板数量不仅较治疗前高，还高于常规治疗患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）；且左卡尼汀组患者Calcein值同样高于常规治疗患者和治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05）；而左卡尼汀治疗的患者入院后3、7 d低线粒体膜电位细胞含量均较治疗前降低（P＜0.05），且下降程度均高于对照组（P＜0.05）；左卡尼汀治疗的患者血小板内ATP含量同样是入院后3、7 d均较治疗前明显升高（P＜0.05），且均高于对照组（P＜0.05）。说明左卡尼汀可明显改善线粒体膜通透性及膜电位，使线粒体功能恢复，从而增加血小板能量供应，阻止血小板凋亡。

综上所述，应用左卡尼汀注射液4 g静脉滴注能够有效改善脓毒症休克患者血小板线粒体结构和功能，并阻止血小板凋亡。

表4 血小板细胞内ATP含量的变化Tab.4 Changes of ATP content in platelet

参考文献

［1］SINGER M，DEUTSCHMAN C S，SEYMOUR C W，et al.The third international consensus definitions or sepsis and septic shock（Sepsis⁃3）［J］.JAMA，2016，315（8）：801⁃810.

［2］JEGER V，DJAFARZADEH S，Jakob S M，et al.Mitochondri⁃al function in sepsis［J］.Eur J Clin Invest，2013，43（5）：532⁃542.

［3］SINGER M.The role of mitochondrial dysfunction in sepsis⁃induced multi⁃organ failure［J］.Virulence，2014，5（1）：66⁃72.

［4］SCHMITTINGER C A，WURZINGER B，DEUTINGER M，et al.How to protect the heart in septic shock：a hypothesis on the pathophysiology and treatment of septic heart failure［J］.Med Hypotheses，2010，74（3）：460⁃465.

［5］DURAN⁃BEDOLLA J，MONTES DE OCA⁃SANDOVAL MA，SALDAÑA⁃NAVOR V，et al.Sepsis，mitocho⁃drial failure and multiple organ dysfunction［J］.Clin Invest Med，2014，37（2）：58⁃69.

［6］ZAMMIT V A，RAMSAY R R，BONOMINI M，et al.Carni⁃tine，mitochondrial function and therapy［J］.Adv Drug Deliv Rev，2009，61（14）：1353⁃1362.

［7］PATEL S P，SULLIVAN P G，LYRTTLE T S，et al.Acetyl⁃L⁃carnitine ameliorates mitochondrial dysfunction following con⁃tusion spinal cord injury［J］.J Neurochem，2010，114（1）：291⁃301.

［8］LI X ZHANG C， ZHANG X，et al．An acetyl⁃L⁃carnitine switch on mitochondrial dysfunction and rescue in the ，metabo⁃lomics study on aluminum oxide nanoparticles［J］.Part Fibre Toxicol，2015，13（1）：4⁃23.

［9］ZHANG Z Y，FAN Z K，CAO Y，et al．Acetyl⁃L⁃carnitinea meliorates mitochondrial damage and apoptosis following spinal cord injury in rats［J］.Neurosci Lett，2015，14（604）：18⁃23.

［10］ARAFA H M，HEMEIDA R A，HASSAN M I，et al.Acetyl⁃L⁃carnitine ameliorates caerulein⁃induced acute pancreatitis in rats［J］.Basic Clin Pharmacol Toxicol，2009，105（1）：30⁃36.

［11］TUFEKCI O，GUNES D，OZOGUL C，et al.Evaluation of the effect of acetyl L⁃carnitine on experimental cisplatin nephrotox⁃icity［J］.Chemotherapy，2009，55（6）：451⁃459.

［12］HOTA K B，HOTA S K，CHAURASIA O P，et al.Acetyl⁃L⁃carnitine⁃mediated neuroprotection during hypoxia is attributed to ERK1/2⁃Nrf2⁃regulated mitochondrial biosynthesis［J］.Hip⁃pocampus，2012，22（4）：723⁃736.