不同宫颈病变高危型人乳头状瘤病毒载量对局部调节性T 细胞表达的影响

余杨 付艳丽 孙翔

河南理工大学第一附属医院（河南省焦作市第二人民医院）检验科（河南焦作 454100）

高危型人乳头状瘤病毒（HR⁃HPV）持续性感染是导致宫颈上皮内瘤变（CIN）及宫颈癌的主要病因，临床上近100%的宫颈癌由HPV感染引起［1-3］。宫颈病变是渐慢演变可逆转的过程，我国HPV的感染率为10%～15%，仅少数进展为CIN，0.35%罹患宫颈癌［4］，基于HR⁃HPV建立可进一步分选出高级别CIN和宫颈癌高危人群的合理筛查体系是目前研究的难点和重点。HPV感染后的疾病转归与机体免疫功能，龙其是与宫颈局部微环境免疫功能密切相关［5］。免疫抑制细胞构筑的免疫抑制微环境通过免疫耐受、免疫逃逸等机制促进宫颈病变的进展［6］，即使宫颈癌阶段，肿瘤细胞处在快速生长阶段或是晚期阶段，机体内部仍存在抗肿瘤免疫反应，只因肿瘤免疫抑制微环境的控制无法发挥生物效用，由此可见免疫抑制微环境的重要性。调节性T细胞（Treg）是一群发挥免疫抑制功能独特的辅助性T细胞亚群，叉头翼状螺旋转录因子3（Foxp3）是Treg的特征性分子标志，通过多种方式对肿瘤免疫应答从启动到效应的整个阶段全程调控，在肿瘤免疫逃逸中起着重要作用。本实验以HR⁃HPV持续感染所致宫颈病变的不同为切入点，监测宫颈局部微环境HR⁃HPV DNA和CD4+CD25+Foxp3+Treg的水平变化，分析HPV持续性感染和免疫系统相互作用的多样表现，探讨HR⁃HPV、Treg细胞、宫颈病变进程三者的联系和发展趋势，并进一步了解Treg细胞对宫颈病变进程或促进或抑制的双向影响，为HR⁃HPV感染者更深入的分流诊治提供临床依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择我院2012年1月至2015年5月收治的HR⁃HPV持续性感染的不同宫颈病变病例，包括CINⅠ53例、CINⅡ55例、CINⅢ58例，宫颈鳞癌86例，慢性宫颈炎52例，均经病理检查确诊。年龄34～55岁，中位年龄43.4岁，不同宫颈病变组的年龄无显著差异，具有可比性。HR⁃HPV以16型、52型、58型为主，其次31型、33型，其余为少见分型，所有患者既往无免疫系统缺陷病史，近期未使用过免疫抑制类药物。持续性HR⁃HPV感染定义为：HR⁃HPV感染者每6个月随访1次，在间隔6～12个月的相邻2次随访中，同一患者的宫颈检测样本均显示HR⁃HPV阳性且为同种类型［7-8］，随访持续时间均在2年以上。所有标本采集患者本人均知情同意。

1.2 主要仪器与试剂 流式细胞仪采用美国BD FACS Calibur，配有BD CellQuest软件。试剂：鼠抗人FITC⁃CD4单克隆抗体、鼠抗人PE⁃CD25单克隆抗体、鼠抗人PE⁃Cy5⁃Foxp3单克隆抗体均购自美国eBioscience公司。PCR扩增仪DA7600型和高危型HPV 核酸定量（16、18、31、33、45、52、56、58共8个型）检测试剂盒均由中山大学达安基因公司提供。

1.3 方法

1.3.1 采用宫颈刷检物制备宫颈病变单细胞悬液 用阴道窥器暴露宫颈，干棉球拭净宫颈口过多的分泌物，观察宫颈，将刷头插入宫颈管，其中央较长的刷丝针对新鲜病变部位，顺时或逆时针旋转3～5圈，取下刷头，并将其浸泡在含液基细胞学保存液的瓶中，300目尼龙网过滤杂质，取此保存液10 mL转入15 mL试管，离心5 min（1 500 r/min），弃上清液，取2 mL沉淀液，以磷酸盐缓冲溶液（PBS）漂洗2～3次，500 r/min离心沉淀1～2 min，进行细胞计数，不少于106个。

1.3.2 流式细胞仪检测单细胞悬液中Treg细胞 调整细胞浓度至1～2×107个/mL，用PBS洗涤、重悬，取上述细胞100 μL，加入FITC⁃CD4、PE⁃CD25各5 μL，混匀，室温避光20 min，加冷固定破膜剂1 mL，4℃避光孵育30 min，加破膜缓冲液2 mL，洗涤2次，弃上清，加PE⁃Cy5⁃Foxp3抗体进行细胞内染色，4 h内进行流式细胞仪检测。用空白管调节电压，以CD25同型对照调节补偿，确定CD4+CD25+细胞群，再以CD4+CD25+细胞设门，以Foxp3同型对照确定阳性信号，最后测定CD4CD25Foxp3管，检测CD4+CD25+Foxp3+细胞占CD4+细胞中的比值。

1.3.3 HPV DNA定量检测 无菌条件下采用宫颈刷插入宫颈内，旋转数周后停留片刻取出，将宫颈刷置入无菌管，采集的宫颈分泌物及时送检或4℃保存，1周内检测。DNA提取和PCR扩增按其说明书（PCR荧光法）进行具体操作。判断标准：HPV⁃DNA ＞103copies/mL为阳性。根据HR⁃HPV核酸定量检测的拷贝数分为4组：低载量组（104～105copies/mL）、中载量组（105～ 106copies/mL）、高载量组（106～107copies/mL）、超高载量组（＞107copies/mL）。

1.3.4 绘制HR⁃HPV DNA标准曲线 PCR荧光法阈值设定原则是值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点，且循环阈值（Ct）不出现任何数值。以4个浓度（1×103～1×106copies/mL）标准品的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线。Ct值与样本起始模板的拷贝数呈正相关，与起始模板拷贝数对数值间有严格的线性反比关系。

1.4 统计学处理 计量数据用±s表示，应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。病毒载量经log转换，多组间均数比较采用单变量两因素主效应和交叉效应方差分析，进一步LSD⁃t检验进行多组均数的两两比较，选用简单箱图解析数据分布。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同宫颈病变和不同HR⁃HPV病毒载量CD4+CD25+Foxp3+T细胞的表达 见图1、2。

图1 不同病毒载量Treg细胞的表达差异Fig.1 Differential expression of Treg cells with different viral load

图2 不同宫颈病变Treg细胞的表达差异Fig.2 Differential expression of Treg cells in different cervical lesions

慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌患者的Treg细胞中位数/四分位距依次为6.00%/1.00、6.00%/1.00、6.83%/2.05、8.00%/1.72和 9.00%/2.32，在慢性宫颈炎、CINⅠ共有4个温和的异常值，其余病变组没有异常值，宫颈癌组的数值分布最为分散，低病变组的数值分布更为集中。

低载量组、中载量组、高载量组、超高载量组患者的Treg细胞中位数/四分位距依次为5.00%/1.00、6.00%/1.00、8.00%/1.36、10.00%/2.09，中载量组有1个温和的异常值，其余组别没有异常值，超高载量组的数值分布最为分散，中低载量组的数值分布更为集中。

2.2 不同宫颈病变和不同HR⁃HPV病毒载量的CD4+CD25+Foxp3+T细胞的表达差异比较 见表1和图3。

表1 不同宫颈病变和不同HR⁃HPV病毒载量的CD4+CD25+Foxp3+T细胞表达的方差比较Tab.1 The variance of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells in different cervical lesions and different HR⁃HPV viral load

图3 宫颈病变病毒载量两因素交互效应的Treg细胞均值分布图Fig.3 Mean distribution of Treg cells in two factor interaction effects on viral load and cervical lesions

整体方差分析显示：宫颈局部Treg细胞Foxp3+表达在不同的宫颈病变、不同拷贝数的病毒载量之间的比较差异有统计学意义（F=24.93，109.86，P＜0.05），提示不同程度宫颈病变患者的Foxp3+表达水平不同，不同宫颈病变在不同病毒载量作用下Treg细胞的表达水平亦有很大变化，宫颈病变和病毒载量的交互作用显著（F=3.39，P＜0.05），提示不同程度的宫颈病变和不同载量的病毒负荷除各自对Treg细胞有显著的单独影响外，在病变程度和病毒载量的不同组合上亦存在附加作用，且不同组别的宫颈病变患者Treg细胞的表达随病毒载量的变化趋势存在差异，遂再行进一步细化的两两比较：在5组不同程度病变的两两比较中，Treg细胞的表达水平在慢性宫颈炎和CINⅠ之间差异无显著性（P＞0.05），其他组组间比较差异均有显著性（P＜0.05）；在4组病毒载量的两两比较中，Treg细胞的表达水平在低载量和中载量之间差异无显著性（P＞0.05），其余组别间差异均有显著性（P＜0.05）。

图3可见宫颈病变和HR⁃HPV病毒载量对Treg细胞表达存在交互影响作用，总体呈现随着宫颈病变程度加重，级别增高，HR⁃HPV病毒负荷数升高，Treg细胞表达上升的趋势，具体变化有：CINⅠ到CINⅡ，低和中载量组趋于平稳，高载量组温和升高，超高载量组持续上升，CINⅡ到CINⅢ中载量组变化不大，其余3组加速上升，CINⅢ到宫颈癌，中和超高载量组继续上升，其余2组小幅上升，波动不大。

3 讨论

HPV感染不是全身的，不通过血液传播，宫颈局部免疫状态和外周血反应的全身免疫状态因微环境的差异不完全一致。目前普遍认为HR⁃HPV持续性感染与宫颈局部免疫微环境改变的协同叠加作用，促使宫颈癌发生［9］。免疫和炎症是构成宫颈局部微环境的两大基本特征，宫颈局部微环境浸润大量免疫细胞，各种免疫细胞相互协调形成网络共同维持机体的免疫稳态，一方面体现了机体免疫调控的精细化，通过自我调节维护过度自身免疫反应和有效免疫效应之间的平衡，这种调控机制贯穿免疫应答的全过程，另一方面提示机体免疫调控的复杂性。在宫颈病变发展过程中，抑制性细胞群体发挥着重要的负调节作用，通过免疫抑制控制炎症范围和强度。研究发现很多病变的早期，机体的全身免疫功能并未出现明显的改变，但病变局部即已存在免疫抑制。Treg细胞正是具有免疫抑制特性的T细胞，无论体内还是体外，都具有强大的免疫抑制活性，可抑制非特异性免疫及特异性免疫，通过调节目标细胞的活化、增殖及细胞因子分泌等发挥作用［10］，在感染慢性迁延以及肿瘤的发生、发展中发挥重要作用，文献报道［11］，FoxP3+Treg表达强度与 HPV16基因组整合所致宫颈病变的恶性转化关系密切。

对实验所得数据进行分析，以宫颈局部微环境Treg细胞表达水平为变量的方差分析显示，宫颈病变和HR⁃HPV病毒载量两因子之间存在交互效应（病变*病毒载量P＜0.05），交互均值分布轮廓图（图3）直观地显示了这一点，如果仅进行某一因素的单独效应分析，不能展现Treg细胞在不同因素联合作用下的表达特点和规律。宫颈病变的不同程度和HR⁃HPV病毒的不同载量对宫颈局部微环境Treg细胞表达均有影响，整体差异有显著（均P＜0.05），两两比较：Treg细胞的表达水平在慢性宫颈炎和CINⅠ之间、低载量和中载量之间差异均无显著性（P＞0.05），其他组组间差异均有显著性（P＜0.05）。同等程度的宫颈病变在高和超高病毒载量时Treg细胞高表达，超高病毒载量时达高峰，同一病毒载量组别在高级别CIN（CINⅡ+）和宫颈癌Treg细胞表达水平较高，宫颈癌时达到高峰。进一步细化比较发现：Treg细胞均数在宫颈癌和超高病毒载量组群波动范围大，在低度病变和低载量时波动幅度小，推测宫颈恶性癌变和超高的病毒载量在Treg细胞表达上发挥了更大和更为复杂的作用，在不同程度的宫颈病变、不同拷贝数的HPV病毒载量中Treg细胞表达量及其发挥的功能和由此产生的重要作用并不相同。Treg的免疫抑制作用在HR⁃HPV相关性宫颈病变的进程变化中，可能具有双向调节作用：（1）对HPV诱导的持续炎症刺激形成保护性生理防御反应，在防止过强的免疫损伤和清除病原体之间维持平衡，以减缓组织病理损害；（2）免疫逃逸导致机体对肿瘤的免疫无应答或免疫反应低下，促使宫颈癌变。结合本实验研究，Treg细胞在程度较低的宫颈病变和低拷贝的病毒载量时，作用较一致，其表达水平的升高更多是一种应激性保护防御反应的正向作用，提示Tregs细胞在病毒感染过程中可使组织损伤程度最小化［12］，致使HR⁃HPV感染虽持续存在，但患者病情较轻。Treg细胞在CINⅢ/宫颈癌和高/超高拷贝的病毒载量时，三者之间有较大的不一致表现，呈现较复杂和特殊的组合模式：（1）CINⅢ/宫颈癌+低载量+Treg细胞较高表达量；（2）CINⅢ/宫颈癌+中载量+Treg细胞较高表达量；（3）CINⅢ/宫颈癌+高/超高载量+Treg细胞较低表达量等，考虑可能原因有：（1）高病毒载量时T细胞耗竭；（2）病毒载量与病毒整合率不尽相同；（3）病变进展到重度CIN和宫颈癌程度后，细胞的恶性转化不再依赖HR⁃HPV的高载量；（4）HR⁃HPV持续性感染是宫颈癌发生的必要条件，而非充分条件。由此推测，随着CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞在CD4+T细胞占比的增加，T细胞及各亚群细胞间比例失衡，宫颈微环境免疫抑制加重，干扰机体对HPV复制的免疫控制，病毒大量复制，感染持续存在日渐严重，打破了机体微环境抗癌/促癌的内在平衡，加剧宫颈病变从宫颈炎→CIN→宫颈癌的顺向发展，由此可见免疫抑制在整个病变链条中的重要作用，与文献报道宫颈癌的免疫状态为免疫耐受或免疫逃逸一致［13］。

总之，HR⁃HPV持续感染是宫颈病变进展恶化的首要条件，宫颈局部微环境免疫失衡是关键环节，宫颈局部Treg细胞、宫颈病变、HR⁃HPV病毒载量三者同向变化中存在差异性波动，即使宫颈癌阶段也非完全同步，这反映了人体免疫系统与HPV感染之间抗衡的多样性和复杂性。因此，从宫颈局部微环境入手，改善被HPV干扰和破坏的生理状态，兼顾正相和负向调控机制，维持机体最为适当的抗肿瘤免疫应答，为高级别CIN和宫颈癌的防护提供新思路。

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