日本猪δ冠状病毒的遗传特征及致病性

杜皓云 译

一、介绍

冠状病毒亚科的冠状病毒传统上分为3个属，即α冠状病毒，β冠状病毒和γ冠状病毒。最近增加了另一种新型属，δ冠状病毒。在不同的宿主物种中发现了这类病毒，包括一些哺乳动物和鸟类物种。此后，2014年在美国俄亥俄州首次发现PDCoV/SDCV，并在美国的其他州也发现了这种病毒。最近在韩国，中国，泰国和老挝等亚洲国家也有发现PDCoVs。PDCoV是一种有囊膜的正向单链RNA病毒。

据日本农业部报道，2013年10月-2015年9月，日本已发生1 000多起PED疫情，几乎遍布所有地区。然而，自2014年以来，研究人员对几个猪场的腹泻粪便样本进行检测，发现样品中猪流行性腹泻病毒（PEDV），传染性胃肠炎病毒（TGEV），其他肠道病毒（轮状病毒和肠道病毒）呈阴性。之前有研究报道称，在PEDV流行的美国一些地区，患猪的粪便样本中可同时检出PDCoV。此外，已经有三个研究小组证明PDCoV在实验感染的猪中具有致病性。因此，这些发现表明PDCoV是除PEDV之外，在日本的多个猪场引起腹泻暴发的主要病原体之一。

本文中研究人员对2013年至2014年间来自腹泻猪的大量粪便样本的PDCoV进行了特定PCR检测，以确认PDCoV在日本的流行，此外，研究人员使用新一代测序技术确定了7个日本PDCoV毒株的完整基因组序列，并使用这些序列通过比较和遗传进化分析来表明日本PDCoV毒株与其他国家公布的PDCoV毒株之间的遗传关系。此外，研究人员对YMG/JPN/2014的日本PDCoV毒株接种剖宫产初乳剥夺的仔猪进行了致病性研究。

二、 材料和方法

1.PDCoV的样品采集。样品来自在2013年11月—2014年8月期间，日本全国17个地区的多个养猪场发生腹泻仔猪或猪。研究人员对477份粪便样品进行了PDCoV的特异性PCR检测，样品中的PEDV，TGEV和其它肠道病毒（轮状病毒和肠道病毒）特异性PCR检测结果呈阴性。将粪便样品制备成在磷酸盐缓冲盐水中稀释的10%悬浮液，4℃，3 000g 离心 10min。 使 用 QIAamp病毒RNA提取试剂盒提取病毒RNA。通过实时荧光定量PCR（RTPCR）来检测粪便样品中的病毒。

2.全基因组测序和进化分析。使用 PrimeScripthigh Fidelity RT-PCR试剂盒，用随机6聚体引物从72个PDCoV特异性PCR阳性样品中合成DNA（cDNA）。从cDNA中产生几乎完整的基因组，其由8个重叠的扩增子组成（约4 kb长）。将8个扩增子以等量合并，并使用新一代测序技术进行分析。

3.病毒分离。将猪睾丸（ST）细胞维持在补充有10%胎牛血清（FBS）的生长培养基中。将6孔板中每孔ST细胞接种200μl 10%肠内悬浮液，这些悬浮液含有5 μg/ml胰蛋白酶而不含FBS的生长培养基稀释。在37℃和5%CO2培养箱中培养1h后移除接种物，并用不含FBS的生长培养基洗涤细胞3次，并对每孔细胞加入3ml胰蛋白酶培养基。直到观察到以圆形细胞为特征的细胞病变效应（CPE），以 5d的间隔在ST细胞中传代分离的病毒。用胰蛋白酶培养基连续稀释该病毒原液10倍，并以每孔100μl接种于96孔板中生长的ST细胞中，每次稀释8个孔。该平板在37℃，5%CO2下孵育7d。每日监测病毒CPE，根据Reed和Muench描述的方法测定病毒滴度，并表示为TCID50/ml。

4.动物实验设计。从两种特定的无特定病原体母猪中获得了初乳缺乏的新生仔猪，它们对传染原非常敏感。将11只小猪（3日龄）随机分成两组：接种日本PDCoV分离株，YMG/JPN/2014的组1和组2（阴性对照组）。第1组的个体口服接种2×106TCID50/头的病毒量。从接种后 0d（DPI）至 8d（DPI）每天收集每只小猪的粪便样品，然后第8dPI后每3～4d收集每只小猪的粪便样品。从0dPI至8dPI每隔2d从每只小猪采集血清样品，在8dPI之后每3～4d采集血清样品。分别在4和7dPI 从组1中随机挑3只和组2中挑1只仔猪处安乐死进行病理学检查，监测每组剩余的仔猪的临床表现和病毒排放直至27dPI。为了检查病毒分布情况，从接种PDCoV和对照的小猪中采集小肠和大肠及其他器官。

根据上述方法从动物收集的10%粪便悬浮液，血清和10%组织匀浆中提取病毒RNA。通过RTPCR确定粪便，血清和各种组织中的病毒含量。

5.PDCoV特异性兔抗血清的制备。研究人员从美国国家兽医服务实验室获得美国PDCoV分离株，Michigan/8977/2014株，以产生PDCoV的兔抗血清。

通过间接免疫荧光测定法（IFA），研究人员使用FITC标记的山羊抗兔IgG抗体评估其针对PDCoV的兔抗血清在接种美国PDCoV分离株的ST细胞上的特异性。此外，通过IFA评估与PDCoV特异性兔抗血清的交叉反应，但是抗血清不与PEDV和TGEV反应。通过IFA评估与PDCoV特异性兔抗血清的交叉反应，但抗血清不与PEDV和TGEV反应。

6.免疫组织化学（IHC）。在 4dPI，7DPI和 27dPI下接种 PDCoV的和对照小猪的小肠和大肠以及其他器官用10%福尔马林浸泡，石蜡包埋，切片，并安装在载玻片上。用PDCoV特异性兔抗血清作为第一抗体用二氨基联苯胺作为第二标记抗体对组织进行染色。

三、结果

1.日本PDCoV流行概况。在使用477个粪便样品的PDCoV调查中，根据PDCoV特异性实时RTPCR，72个样品（15.1%）呈阳性。表1总结了各年龄组PDCoV阳性样本的检出率。根据PDCoV的特异性PCR，母猪中几乎有一半（48.3%）为阳性。育肥猪（120日龄以上）和断奶仔猪（21～60日龄）分别以10.5%和10.3%显示次高的阳性率。另外，研究人员的调查显示自2014年2月以来，PDCoV在日本一直存在。

2.全基因组测序和进化分析。使用新一代测序技术分析7个日本PDCoV毒株的完整基因组。表2总结了7种日本PDCoV毒株的信息。基于完整基因组的进化分析表明，2014年在日本检测到的7种PDCoV毒株与从2013年到2016年在美国和韩国的检测的PDCoV毒株相关，来自日本和其他国家的PDCoV毒株的基因组比较分析显示，日本PDCoV毒株的完整基因组与美国和韩国PDCoV毒株几乎完全相同（99.7%～100%同一性），这些毒株与包括香港PDCoV毒株的中国PDCoV毒株和泰国，越南和老挝PDCoV毒株相比具有相当的差异（表3）。

3.病毒分离。分离的病毒在ST细胞中有效地繁殖3代。通过RTPCR和免疫荧光测定，将分离株YMG / JPN / 2014 评估为 PDCoV。该分离株在ST细胞中另外繁殖4次，当用于实验研究时其滴度为106TCID50/ml。

4.临床症状和排毒。接种PDCoV的新生仔猪在2～11dPI期间出现急性水样腹泻，厌食，毛发枯燥和严重的虚脱，然后在整个观察期间全部恢复并存活。在PDCoV接种的小猪的粪便和血清样品中检测到的PDCoV RNA显示在图2中。用日本PDCoV分离株接种

通过使用RT-PCR，在4和7DPI检查PDCoV接种组的各种组织中的病毒分布（图3）。在接种PDCoV的组中，病毒主要在从近空肠到直肠的肠组织中检测到，并且在4dPI时在肠系膜淋巴结中以108～1010拷贝/ml的范围检测到病毒。此外，4dPI时，PDCoV特异性PCR还检测到来自肝脏，2/3的胃，十二指肠样品和1/3肌肉样品的超过107的病毒RNA拷贝。在7DPI时，病毒主要分布在大肠。此外，从肠系膜淋巴结和2/3远端空肠和回肠样本中检测到超过107个病毒基因组拷贝。根据PDCoV特异性PCR，阴性对照组中的所有仔猪，血清和组织样品均为阴性。

5.免疫组织化学。在4DPI尸检时使用PDCoV特异性兔抗血清（表5），IHC染色检测来自PDCoV接种组的样品中从近端空肠至结肠的绒毛细胞质和隐窝肠上皮细胞PDCoV抗原。PDCoV接种仔猪的平均IHC评分在空肠近端和盲肠至结肠低，中肠空肠至回肠高，十二指肠和直肠阴性。在7dPI，病毒主要分布在大肠，从盲肠到结肠病毒含量低。在27dPI时，在PDCoV接种组的任何组织中未鉴定到阳性染色。在阴性对照小猪的所有检查组织中未检测到IHC染色。

四、 讨论

研究人员的调查显示，在2013年-2014年，在日本几个县的腹泻猪中获得477个PEDV，TGEV和其他肠道病毒阴性粪便样品中，有72个样品（15.1%）PDCoV呈阳性。PDCoV阳性样本的检出率与2014年1～2月在美国收集的猪样本调查中观察到的相似（22%）。因为研究人员没有收集腹泻样本的猪群的详细信息，他们的数据不能否认这些腹泻可能是由其他病原体（细菌和寄生虫）引起的可能性，但是表明PDCoV会与这些腹泻相关。此外，他们的数据还表明，PDCoV可以感染所有年龄组，类似于PEDV。特别是，研究者的调查显示了带PDCoV的母猪为最高的阳性检测率。事实上，美国首次发现PDCoV的报道显示，美国的PDCoVs是在患有水样腹泻的母猪检测到的。在临床观察中，母猪不仅表现出严重的腹泻，还表现出呕吐和厌食。这些发现表明，老年猪对PDCoV可能比仔猪更敏感。然而，其假设将需要在未来进行进一步验证。

利用基因组序列构建进化树表明，日本检测到的7种PDCoV毒株与在2013—2016年来自美国和韩国的毒株相似。日本收集的PDCoV毒株与2004—2016年在其他国家收集的PDCoV毒株的基因组比较分析显示，来自日本的PDCoV毒株的完整基因组几乎与来自美国和韩国的完全基因组相同（99.7～100%）。因此，自2014年以来在日本出现的PDCoV毒株与自2013年以来在美国和韩国出现的那些毒株在遗传上有关。此外，2014年以来发生在日本的PDCoV暴发可能是由于来自其他大型猪业的PDCoV毒株入侵日本而造成的。

为了测试YMG/JPN/2014毒株的致病性，使用剖宫产初乳剥夺的新生仔猪进行实验性感染。在临床观察中，感染该毒株后少数仔猪中出现轻度腹泻，无呕吐和厌食，但感染后的仔猪在5d后从腹泻中恢复。相比之下，用日本PDCoV分离株接种的仔猪在2dPI时患有严重腹泻，但是在11dPI时全部从腹泻中恢复，并且存活直至27dPI。因此，PDCoV分离毒以及野毒使仔猪产生了腹泻。然而，研究中仔猪腹泻的严重程度和持续时间的差异可能是由不同的条件引起的，如接种量或宿主的易感性。

总之，研究人员首先发现自2014年2月以来PDCoV已在日本出现。他们的分析表明，自2013年底以来，PDCoV可能是导致日本猪群腹泻的暴发的病原体。由于该研究中检测到的PDCoVs与2013年以来在其他猪生产国家（如美国和韩国）出现的毒株有关，它们可能代表海外入侵，如PEDV入侵日本。