响应面法优化三白草总黄酮的微波提取工艺

冯海燕，孙伟晗，刘佳旺

（石家庄学院 化工学院，河北 石家庄 050035）

0 引言

三白草别称塘边藕、水木通，多年生草本植物，主要分布于河北、河南、山东和长江流域及其以南各地，具有清热解毒、利水消肿之功效，可用于治疗尿路感染、尿路结石、肾炎水肿、皮肤湿疹和疔疮等[1].研究表明，黄酮类化合物是三白草的主要活性成分之一，具有保肝抗炎、降低血糖的作用[2]，因此三白草总黄酮的提取具有重要意义.汪怡等[3]和冯海燕等[4]分别对三白草总黄酮的热回流提取工艺和超声提取工艺进行了研究和优化，采用的均为正交设计试验.

响应曲面法（RSM）是一种优化多变量系统的有效实验工具[5].它通过拟合响应值和各因素的相互关系，在一定的优化区域内能以简单、高效的方式找到各因素最佳水平的组合，克服了正交设计试验只能处理孤立实验点的不足[6].在单因素试验的基础上，采用响应曲面分析法对三白草总黄酮的微波提取工艺进行了优化，旨在为三白草的进一步开发利用提供技术支持和参考.

1 实验部分

1.1 材料和仪器

1.1.1 材料

芦丁（批号：100080-200707，中国药品生物制品检定所），无水乙醇、三氯化铝、冰醋酸、醋酸钠均为分析纯.

三白草购于河北省安国市旭芳中药材经营有限公司，经石家庄学院化工学院生药教研室岳红坤副教授鉴定为真品.

1.1.2 仪器

MCR-3常压微波化学反应器（巩义市予华仪器有限公司），TU-1950双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），FW-100高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）.

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的绘制

精密称取芦丁5.6 mg，置于小烧杯中，用无水乙醇溶解，定量转移至50 mL容量瓶中，并用无水乙醇定容，即得芦丁对照品溶液.分别量取芦丁对照品溶液0.0，1.0，2.0，2.5，3.5，5.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加无水乙醇至8 mL，依次加入0.1 mol/L AlCl3溶液3 mL，pH=4.5的HAc-NaAc缓冲溶液5 mL，再加水定容，混合均匀后静置15 min，用紫外分光光度计测定溶液在406 nm处的吸光度.以浓度C（μg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，进行线性回归.工作曲线为：A=0.0358 2+0.0322 7C，r=0.999 3，说明线性关系良好.

1.2.2 三白草的预处理

将三白草用粉碎机粉碎，按1 g三白草：6 mL石油醚（60～90℃）的比例加入石油醚，热回流6 h，脱脂、脱色.减压过滤后将三白草粉末置于干燥箱中，60℃烘干8 h，待用.

1.2.3 供试品溶液的制备

准确称取1.0 g三白草粉末，按某一液料比加入某一体积分数的乙醇溶液，在一定的微波功率下微波提取一定时间.提取液减压抽滤，定容，即得供试品溶液.

1.2.4 总黄酮含量的测定

精密量取4 mL供试品溶液，转移至25 mL容量瓶中，按1.2.1节的方法，测定溶液在406 nm处的吸光度，根据工作曲线计算三白草中总黄酮的含量.

1.2.5 方法学考察

1.2.5.1 精密度实验

对同一供试品溶液，平行量取5份，每份4mL，分别按1.2.1节所述方法测定吸光度，吸光度的相对标准偏差（RSD）为0.81%.

1.2.5.2 重复性实验

准确称取1.0 g三白草5份，在相同的实验条件下微波提取，过滤，定容，测定.总黄酮的含量分别为13.00，12.96，13.18，13.36，12.78 mg/g，平均含量为 13.06 mg/g，RSD 为 1.70%（n=5），说明所建方法重现性良好.

1.2.5.3 加标回收率实验

精密量取3份已测定含量的供试品溶液1.0 mL，分别加0.8，1.1，1.4 mL芦丁对照品溶液，按照1.2.1节的方法测定溶液的吸光度，计算回收率.平均回收率为100.3%，说明方法的准确度较高.

1.2.6 试验设计

选择乙醇体积分数、提取时间、微波功率和液料比作为研究因素，进行单因素试验.在此试验基础上，选取3个对三白草总黄酮提取效果影响较大的因素，进行三因素三水平的响应曲面分析，对提取条件进行优化.

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

实验考察了4个选定因素对三白草总黄酮提取效果的影响，结果如图1～图4所示.可以看出，随液料比的增大，三白草总黄酮的提取量明显增加，当液料比超出40 mL/g以后，再增加溶剂用量，总黄酮提取量基本趋于稳定（图1）.其他3个因素对三白草总黄酮提取量的影响呈现相同的变化，均随这3个因素的增加，提取量先增后减（图2～图4），其中微波功率对提取效果的影响较不明显（图4）.

图1 液料比的影响

图2 提取时间的影响

图3 乙醇体积分数的影响

图4 微波功率的影响

2.2 响应面法优化试验

2.2.1 分析方案及结果

由于微波功率的变化对总黄酮提取量的影响较小，试验中将其固定在480 W，选择乙醇体积分数、提取时间、液料比3个因素进行三因素三水平的Box-Behnken响应曲面设计试验，具体的因素水平见表1，试验设计及结果见表2.

表1 响应面分析因素及水平

表2 响应曲面的分析方案及试验结果

2.2.2 回归方程与方差分析

采用Design Expert 8.0.6软件对表2中的17组实验数据进行分析，拟合得到三白草总黄酮含量（Y）对乙醇体积分数（A）、液料比（B）和提取时间（C）的回归方程：Y=+12.19+0.093A-0.088B+0.066C-0.097AB+0.32AC-0.18BC-0.21A2-0.43B2-0.13C2，方差分析结果如表3所示.

表3 二次回归模型的方差分析

由表3可知，回归模型达极显著水平（P=0.000 1），失拟项不显著（P=0.110 9），决定系数=0.939 1，说明回归模型对试验拟合较好，可用于三白草总黄酮提取过程的分析和预测.各因素对总黄酮提取率影响的主次顺序为A（乙醇体积分数）＞B（液料比）＞C（提取时间）.A、B、C2对提取过程有显著影响，交互项AC、BC和二次项A2、B2有极显著影响，说明3个因素对响应值的影响不是简单的线性关系.

2.2.3 响应面分析

根据回归方程，可以得出乙醇体积分数、液料比、提取时间中任意两个因素对三白草黄酮提取率影响的响应面图，结果见图5.

由图5（a）知，总黄酮提取率随乙醇体积分数或液料比的增加均呈先增后降的变化，即这两个因素取值过大过小，都不利于三白草黄酮的溶出.

图5（b）表明，当提取时间一定时，随乙醇体积分数的增加，黄酮提取率先升后降，说明三白草黄酮具有一定的极性[7]；当乙醇体积分数在50%～65%之间时，提取时间增加，黄酮提取率先升后降，乙醇体积分数在65%～70%之间时，黄酮提取率随时间的延长逐渐升高.

图5（c）反映的是当乙醇体积分数为60%时，液料比和提取时间对总黄酮提取率的影响.固定液料比或提取时间，总黄酮提取率均随着另一因素的增加呈先增后降的变化.

响应曲面平面投影的形状可反映出交互作用的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反[8].图5（b）和图5（c）中投影呈椭圆，说明提取时间和液料比之间、提取时间和乙醇体积分数之间交互影响显著，这与表3的数据相一致.

图5 各因素交互作用对三白草总黄酮提取率影响的响应面图

2.2.4 验证试验

回归模型得出的最佳提取工艺参数为：乙醇体积分数70%，液料比45.67 mL/g，提取时间8 min.此条件下得到的响应值为12.40 mg/g.为操作方便，将液料比修正为46 mL/g，微波功率仍固定在480 W.按最佳工艺条件，平行试验3次，三白草总黄酮的实际提取率为12.33 mg/g，与预测值基本吻合.

2.3 对比试验

本试验采用文献报道的热回流法[3]和超声波法[4]对同一批三白草进行了总黄酮的提取，试验结果列于表4.由表4可以看出，超声波法的总黄酮提取率明显低于另外两种方法，热回流法的黄酮提取率略高于微波法，但微波法的提取时间仅为热回流法的三十分之一.综合评价，微波法不失为提取三白草黄酮的一种最优的提取工艺.

3 结论

在单因素试验结果的基础之上，采用响应曲面试验设计，对中草药三白草中的活性成分总黄酮的微波提取工艺进行了优化，得到的最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数70%，液料比46 mL/g，提取时间8 min，微波功率480 W，此条件下黄酮的提取率可达12.33 mg/g.该研究为三白草总黄酮的进一步开发利用提供了实验数据和参考.

表4 不同提取方法黄酮提取率的比较

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010.

[2]肖伟，彭伟，彭勇，等.三白草的研究进展[J].中草药，2010，41（12）：2111-2115.

[3]汪怡，李祥，邱蓉丽，等.三白草中总黄酮醇提工艺的研究[J].中华中医药学刊，2007，25（4）：812-813.

[4]冯海燕，刘闪，张云霄，等.三白草总黄酮的超声波提取工艺研究[J].安徽农业科学，2010，38（15）：7863-7865.

[5]REDDY L V,WEE Y J,RYU H M,et al.Optimization of Alkaline Protease Production by Batch Culture of Bacillus sp.RKY3 Through Plackett-burmanandResponseSurfaceMethodologicalApproaches[J].BioresourceTechnology,2008,99（7）:2242-2249.

[6]王振忠，武文洁.野菊花总黄酮提取工艺的响应面设计优化[J].时珍国医国药，2007，18（3）：648-650.

[7]朱家校，何伟，李勇，等.响应面分析法优化川芎藁本内酯提取工艺的研究[J].中成药，2011，33（12）：2172-2175.

[8]李小菊，张越非，钟玲，等.响应曲面法优化微波辅助提取魔芋葡甘露聚糖的工艺研究[J].时珍国医国药，2013，24（3）：525-529.