可吸收血流导向支架对兔动脉瘤及正常分支的长期作用

燕鲁滨 卢培刚 王奎重 郝振强 王天助 刘慧

(济南军区总医院神经外科，山东 济南 250000)

颅内动脉瘤系颅内动脉壁的异样突起，在临床疾病中异常凶险，本病破裂出血的患者约1/3在就诊前死亡，1/3死于医院内，1/3经过治疗得以生存。血流导向支架(flow diverting stent, FDS)作为一种血管内治疗颅内动脉瘤的装置，在临床上应用十分广泛。

FDS在治愈颅内动脉瘤的同时引发了一系列的并发症，包括载瘤动脉的狭窄、分支动脉的闭塞、颅内出血等。因此，探寻一种安全、有效的FDS成为热点。目前可吸收血流导向支架(biodegradable flow diverting stents, BFDS)在临床上无相关报道，仅仅停留在动物实验阶段，前期我们在利用BFDS治疗兔动脉瘤上收到了预期效果[1]，随着时间的推移，BFDS的疗效有待验证。在现在的实验中，我们将BFDS置入兔体内，观察长期(6个月、12个月)动脉瘤的闭塞情况及其对载瘤动脉、分支动脉的影响。

材料与方法

一、材料

金属裸支架(含22根镍钛合金丝、2根含显影铂金丝，上海微创医疗器械公司)、可吸收外科缝线[商品名：聚乙醇酸(polyglycolic acid, PGA)缝合线(金杰)，8-0 PGA缝合线，上海浦东金环医疗用品公司，产品批号为18Q1219A]、新西兰成年大白兔(体重2.0～2.5 kg，雌雄不限)、盐酸赛拉嗪注射液注射液(商品名：陆眠宁，商品批号151218，吉林省华牧动物保健品公司)、1%的戊巴比妥钠生理盐水溶液、弹性蛋白酶溶液(宁波林叶生物科技公司的弹性蛋白酶粉剂，生产批号为150701，生物活性≥100 U/mg；将该粉剂1 g加入100 mL生理盐水中最终配制成1 U/L弹性酶生理盐水溶液)、注射用青霉素钾(1.0 g 160万单位，哈尔滨摩天农科兽药有限公司，生产批号为20150701)、生理盐水、2%盐酸利多卡因注射液、普通手术剪刀、镊子、眼科剪、眼科镊、眼科撑开器、弯钳、止血钳、小型止血电凝、自制泡沫手术台(X线穿透效果好)、蔡司显微镜、电子秤、手提式压力蒸汽灭菌器、24G静脉留置针、无菌清创缝合包、医用无菌手套、自制弧形动脉瘤夹子(图2)、注射器、数字减影血管造影(digital subtraction angiography, DSA)机器、钢球(直径为0.80 cm)、肝素水(50 U/mL)、泛影葡胺造影剂、阿司匹林肠溶片(25 mg/片)、硫酸氢氯吡格雷片(25 mg/片)、血管夹、5F的股动脉鞘、超滑导丝、导引导丝、4F单弯造影管、导引导管、微导丝、Y阀2个、三通2个、扭空器、导引阀、塑形针、组织固定液(10%磷酸盐缓冲中性福尔马林固定液，济南百博生物科技股份有限公司)、磷酸缓冲盐溶(phosphate buffer saline, PBS)、二甲苯、Weigert氏间苯二酚品红试剂、CD34抗体、αSMA抗体、扫描电镜(齐鲁工业大学分析测试中心)、导电胶布、石蜡切片机、干燥箱。

二、方法

1.BFDS制作过程：在显微镜下将24根PGA缝合线编入金属裸支架中，12枚BFDS消毒备用(图1)。

2.兔动脉瘤的制备过程：①分离出右颈总动脉(right common carotid artery, RCCA)起始部、部分右锁骨下动脉(right subclavical artery, RSCA)及两者分叉处(图2A)。②RCCA起始部2.5 cm处行远心端结扎，起始部1.5 cm只绕一个结而不结扎，动脉瘤夹夹在RCCA起始部和部分RSCA上，确保动脉瘤夹内侧缘在RCCA和RSCA连接处(图2B)。③近心端线节打紧，且在该线节与动脉瘤夹RCC残腔内注入1 mL弹性蛋白酶(图2C)，消化20 min后拔除套管针，结扎RCCA 穿刺口处，小心松开动脉瘤夹，发现RCCA残腔的血管壁透明(图2D)。

图1 显微镜下BFDS(标尺刻度=1 mm)

Fig 1 BFDS under the microscope (one division of the ruler=1 mm)

图2 动脉瘤的制备过程

Fig 2 The process of making the aneurysmal models

A: The crotch between the RSCA and the RCCA (the blue arrowhead represented RSCA, the black arrowhead represented the RCCA; the green arrowhead represented the pneumogastric nerve; the yellow arrowhead represented the jugular vein); B: The location of aneurismal clip; C: Injecting the elastase into the RCCA; D: The RCCA after the injection of elastase.

3.静脉造影(intravenous digital subtraction angiography, IVDSA)筛查：造模后6 w，兔麻醉后，左侧耳缘静脉留置针连接高压注射器，以1.5 mL/s，总量5 mL的造影剂量行IVDSA(造影剂经过右耳缘静脉、右颈静脉、肺循环、左心室、主动脉弓、无名动脉、动脉瘤)筛选出制备成功的动脉瘤模型12只。

4.动脉造影(arterial digital subtraction angiography, DSA)及支架的置入：兔麻醉、分离出股动脉后，股动脉远心端结扎、近心段绕线不打结，两者间血管夹临时阻断血管，在远心端线结和血管夹之间剪开侧口后，超滑导丝引导5F鞘插入股动脉近端并留置鞘在股动脉内(图3)。兔肝素化后，5F导引导管在超滑导丝导引下进入无名动脉，行DSA及3D DSA检查，观察动脉瘤的形态、大小及载瘤动脉直径(表1)。撤出超滑导丝，微导管在微导丝的指引下进入无名动脉跨过瘤颈部到达右椎动脉远端，边撤微导管、边撤导丝，使支架展开后覆盖瘤颈部、右椎动脉开口处。随后将导引导管撤至腹主动脉处行DSA造影并将支架放置在腹主动脉(abdominal aortas, AA)覆盖分支腰动脉开口处(图4 A～C)。所有兔子在术前3 d、术后10 d给予双抗疗法(阿司匹林+硫酸氢氯吡格雷)预防血栓形成。

5.扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)与病理：兔子饲养12个月后，过量戊巴比妥钠(≥ 100 mg/kg)麻醉后，用组织固定液约50 mL进行心脏灌注。在显微镜下仔细分离出动脉瘤、载瘤动脉、主动脉弓、腹主动脉及腰动脉，最后将冲洗干净的标本组织固定液内浸泡至少24 h。将所有标本用导电胶布固定到扫描电镜固定台上，进行喷金以增强扫描图片显示效果，低真空(40 Pa)模式下观察瘤颈部愈合情况和腰动脉开口内膜增生情况(图5)。显微镜下挑净支架后行石蜡包埋(动脉瘤和载瘤动脉长轴与将要切片面平行；腰动脉和腹主动脉长轴与将要切片面平行)，然后在切片机下切成5 μm薄片后所有标本行常规HE染色、CD34及αSMA 免疫组织化学染色：①H-E染色的大体步骤为：两种二甲苯脱蜡；梯度酒精脱水；染色；中性树胶封片。②Weigert氏间苯二酚品红试剂染色大体步骤为：石蜡切片3～5 μm，脱蜡至95%酒精溶液中；该染液染色1～2 h或更长时间；切片从染液取出后直接用95%酒精洗去多余染液，分化至无余色；充分水洗5 min。③免疫组化染色的大体步骤为：切片脱蜡，过氧化氢孵育10 min；蒸馏水冲洗，山羊血清孵育10 min后倾去血清；PBS冲洗多次；添加一抗、PBS冲洗多次后添加二抗、显色剂显色；水冲洗后、复染、封片。

动脉瘤、载瘤动脉、腰动脉开口处直径等各项参数测量均根据DSA机器参照钢球直径测量出。

图3 动脉瘤两种不同支架置入

Fig 3 Aneurysms treated by the BFDS and MFDS

A: DSA showed a saccular aneurysm; B: 3D DSA showed a saccular aneurysm; C: The process of implanting the BFDS; D: The aneurysm was completely occluded by IVDSA after 6 months; E, F: The aneurysm was completely occluded by DSA and 3D DSA after 6 months; G: The aneurysm specimen; H: DSA showed a saccular aneurysm; I: The residual aneurysm less than 50% by IVDSA after 1 year.

A～G: Experimental group; H～I: Control group.

图4 腹主动脉支架置入过程

Fig 4 The abdominal aortas treated by the BFDS

A: The lumbar was clear before implanting the BFDS; B: The lumbar was clear at the moment of implanting the BFDS; C: The lumbar was clear after implanting the BFDS in one year's follow-up.

结 果

一、影像学及统计学结果

FDS置入前，动脉瘤各项参数(瘤高、瘤宽、瘤颈宽)及PA直径在两组之间均无统计学差异(P>0.05)。腰动脉开口处的直径在两组之间无统计学差异(P>0.05)。

FDS置入后12个月后，结合Kamran分级得出两组之间动脉瘤完全闭塞率有统计学差异(P<0.05，表2)。结合分支动脉闭塞情况评分，两组腰动脉开口处闭塞情况在两组之间均有统计学差异(P<0.05，表3)。

二、扫描电镜及病理结果

FDS置入后12个月后，动脉瘤瘤颈部完全被新生内膜覆盖，新生内膜内主要有血管内皮细胞、平滑肌纤维、弹性纤维及胶原纤维组成。腰动脉开口处被部分新生内膜覆盖，新生内膜主要血管内皮细胞、平滑肌纤维、胶原纤维组成(图5)。

图5 12个月后实验组的扫描电镜、病理结果图片

Fig 5 Photographs of SEM and pathological results in the experimental group after 12 months

A: The neointima covered the neck of aneurysm completely under the microscope and SEM; B: The neointima covered the neck of aneurysm completely under the microscope and SEM (×100); C, D: The neointima covered at the edge of the lumbar artery ostium partly under the microscope; D: The neointima covered at the edge of the lumbar artery ostium partly under SEM; E: The neointima (the blue arrowhead) covered the neck of aneurysm completely and surrounded the small hole (H&E, remove of the metal struts produced the small hole); F: CD34-positive endothelium cells (blue) were located at the surface of the neointima; G: α-SMA positive endothelium cells (brown) were located at the surface of the neointima; H: The neointima contained the elastic fibers (blue) and the collagenous fiber (red) (Weigert); I: The neointima covered at the edge of the lumbar artery ostium partly (the blue arrowhead) (H&E); J: CD34-positive endothelium cells (blue) were located at the surface of the neointima; K: α-SMA positive endothelium cells (brown) were located at the surface of the neointima; L: The neointima contained the elastic fiber (red) (Weigert).

Bar=1 mm in Fig A.

GroupHeightWidthNeckPAdiameter BFDS0．40±0．21a0．27±0．15a0．35±0．14a0．30±0．13a MFDS0．30±0．260．18±0．160．25±0．050．20±0．15

aP<0.05,vsMFDS group.

表2 动脉瘤的完全闭塞率 [n(%)]

Tab 2 Complete occlusion ratio of aneurysm [n(%)]

GroupCompleteocclusionNon⁃completeocclusionn Completeocclusion(%) BFDS6(100)a0(0)6100 MFDS1(20)4(80)5b20 Total741163．6

aP<0.05,vsMFDS group; b represents the dead rabbit (excluded).

表3 腰动脉开口处闭塞情况评分[n(%)]

Tab 3 Block rating of the lumbar artery ostium [n(%)]

Groupn1point2points3points4points BFDS63(50)a2(33)a1(17)a0(0)a MFDS50(0)1(20)1(20)3(60)

aP<0.05,vsMFDS group.

讨 论

关于模型动物的选择，虽然兔颈动脉形态学和人血管差距大，但是颈动脉直径与大脑中动脉起始部相似，而且，相对于其他哺乳动物，兔子凝血系统与人最相似[2-3]。在我们的实验中运用Wang等[4]提出的动脉瘤夹临时夹闭结合弹性蛋白酶诱导制作兔动脉瘤模型，该动脉瘤模型与人类动脉瘤具有相似组织学和血流动力学特点，并且动脉瘤的形成至少需要21 d。两组兔子12个月后，动脉瘤瘤颈部发现新生内膜，且新生内膜成分有血管内皮细胞和平滑肌纤维组成。Ding等[5]报道了兔动脉瘤模型在制作5年后依然没有发生动脉瘤的自然闭塞，这给我们在1年以上的时间内排除了动脉瘤“自愈”原因引起的动脉瘤的闭塞。对于实验组除了死亡的1只外，在6个月、12个月的随访中行DSA造影复查动脉瘤闭塞均达到4级；对照组在6个月、12个月随访中行DSA复查动脉瘤闭塞达到4级的仅有1只。

Masuo等[6]在认为人类颅内分支动脉类似兔腰动脉，在金属支架置入腹主动脉的三个月的随访中证实了腰动脉的通畅性。Hong等[7]在研究血流导向支架金属覆盖率与分支动脉口新生内膜的关系时发现：在支架置入即刻或后期影像学随访中未发现分支动脉的闭塞。在扫描电镜下发现，靠近分支动脉口附近的支架和网孔布满新生内膜，但是在分支动脉口中央位置仅有少量纤维蛋白覆盖支架上。在我们12个月的随访中发现，腰动脉开口处确实有内膜增生，而且内膜增生较Hong实验结果明显，但并不是内膜增生仅限于分支开口周围的支架和网孔，而是杂乱无章的，病理结果也证实了覆盖腰动脉开口处的成分是增生的血管内皮细胞、平滑肌细胞及胶原纤维。但两者一致的是DSA在6个月、12个月复查时未发现腰动脉显影不良，因此在BFDS对分支血管的长期影响上来说是有的，但是这个影响仅仅是量变，不会引起质变(分支动脉的完全闭塞，影响血流灌注)。

在Becske等[8]报道过FDS置入载瘤动脉后发生载瘤动脉内血栓形成，狭窄的概率是1.9%。在我们剪开载瘤动脉时发现在支架的管腔内有新生内膜的覆盖，PGA缝合线已经完全降解，HE染色可见PGA降解后残留的空隙，免疫组化显示新生内膜由大部分的αSMA染色阳性的平滑肌细胞和少量CD34阳性的血管内皮细胞组成。 因此我们同样认为在BFDS置入载瘤动脉后对载瘤动脉的影响是有限的。

理想的治疗颅内动脉瘤的支架为动脉瘤闭塞后可以完成自然降解，PGA可吸收支架在心内科治疗冠状动脉狭窄成为热点，并且证明了其可行性。当裸金属支架网丝覆盖率达到35%可引起动脉瘤完全闭塞[9]，可以完全治愈动脉瘤。但是在血流导向支架置入载瘤动脉过程过由于压缩或拉伸作用会引起金属覆盖率的变化[10]。但在我们的实验中BFDS置入载瘤动脉后支架网丝覆盖率没有进行相关计算。

总之，FDS在长期(6个月、12个月)动物实验中证明了其治疗动脉瘤的有效性，对载瘤动脉和正常血管分支的影响是较小的。

参 考 文 献

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