乙醇法提取金银花总黄酮工艺研究

张君　 朱金艳　祝军

摘 要：黄酮类化合物是金银花中含量较多的次生代谢产物，具有多种生物学功效，以乙醇为溶剂，对提取工艺进行研究，结果表明：乙醇含量为70%、固液比1∶19、65℃下浸提3小时为最佳提取条件，样品提取率为3.55%。结果证明采用乙醇提取金银花黄酮是比较有效的途径，且方法操作简单便于推广和普及。

关键词：乙醇；提取；金银花；总黄酮

黄酮类化合物是天然产物，主要存在于植物中，许多药材的有效成分均为黄酮。总黄酮可以改善人体的血液循环，降低人体胆固醇含量，降低心脑血管疾病的发生。它还是一种很强的抗氧剂，可有效清除体内的自由基，可以阻止细胞的退化、衰老，也可阻止癌症的发生，其药理作用以引起重视。随着社会进步和对健康的追求，研究总黄酮类物质取得了一定进步，通过进一步研究，可以发挥其更大的作用，创造更多的机遇，使其在诸多领域发挥重要作用。

本试验采用乙醇法来提取总黄酮类物质，并通过总黄酮类物质的定性鉴定（颜色反应），确定有机溶剂提取液含有黄酮类物质。再利用单因素通过了不同的提取温度、乙醇浓度、时间、液固比等条件对金银花总黄酮提取率的影响，并通过正交试验设计，对乙醇法提取金银花中黄酮类物质的工艺参数进行优化，为企业规模化生产金银花总黄酮提供理论依据，以达到更加充分、合理的利用金银花资源提高金银花附加值的目的。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与设备

1.1.1 材料 市售金银花。

1.1.2 试剂 芦丁标准样品；90%乙醇、浓硫酸、盐酸、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸鋁、锌粉、硼酸等均为分析纯。

1.1.3 仪器设备 TU-1810紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；RE-5299旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；AL204-IC电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 黄酮的提取工艺流程 金银花→烘干→粉碎筛选→配制溶液→恒温提取→离心分离→蒸发浓缩。

1.2.2 金银花总黄酮含量测定 （1）芦丁标准溶液的制备。准确称取11.2毫克芦丁标准品，用90%乙醇溶解，定容至50毫升容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.4毫升，摇匀；放置60分钟后加入4%氢氧化钠溶液4毫升，摇匀；最后用60%的乙醇定容，15分钟后与420纳米处测定吸光值。以芦丁浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。（2）制作金银花总黄酮浓度标准曲线。取10.0毫升芦丁标准溶液置于50毫升比色管中，加入亚硝酸钠溶液（5%）2毫升，摇匀，并静置7分钟，再加入硝酸铝溶液（5%）2毫升，摇匀，再静置7分钟，加入氢氧化钠溶液（10%）5毫升，以无水乙醇定容至刻度，混匀，静置20分钟。以空白试剂为零点，在420nm波长的范围内测定吸光度。准确吸取标准使用液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00毫升分别置于25毫升比色管中，按照上述步骤显色，以空白调零点，在420纳米处测定吸光度。

1.2.3 金银花总黄酮的定性鉴定 量取金银花黄酮提取液80毫升于蒸发仪内浓缩至8毫升，备用。（1）盐酸—锌粉反应。取2毫升样品置于试管中，加少量锌粉，摇匀后，滴加数滴盐酸，当溶液呈粉红色时证明提取液中含有黄酮类物质。（2）硼酸反应。取2毫升样品浓缩液放于试管内，加入少许5%硼酸溶液，摇晃，当溶液无反应时证明提取液中含有黄酮类物质。（3）氢氧化钠反应。取2毫升样品浓缩液放于试管内，加入少许氢氧化钠，摇晃，当溶液呈黄色时证明提取液中含有黄酮类物质。（4）浓硫酸反应。取2毫升样品浓缩液放于试管内，加入少许浓硫酸，摇晃，当溶液呈橙红色时证明提取液中含有黄酮类物质。

1.2.4 单因素试验 （1）固液比对金银花总黄酮提取率的影响。精确称取10克金银花于回流瓶中，分别按1∶15、1∶17、1∶19、1∶21、1∶23的固液比加入70%的乙醇中，于65℃回流3小时。相同条件提取两次，然后将两次滤液合并，蒸发浓缩至100毫升，测定并计算样品液中总黄酮含量。重复三次取平均值。（2）温度对金银花总黄酮提取率的影响。精确称取10克金银花于回流瓶中，以70%乙醇为提取剂，固液比为1∶19，分别在55、60、65、70、75℃回流3小时。常温放置冷却后过滤，滤渣于相同条件下重复提取1次，然后将两次滤液合并，蒸发浓缩至100毫升，测定并计算样品液中总黄酮含量。重复3次取平均值。（3）时间对金银花总黄酮提取率的影响。精确称取10克金银花于回流瓶中，以70%乙醇为提取剂，固液比为1∶19，在65℃分别回流1、2、3、4、5小时。相同条件提取两次，然后将两次滤液合并，蒸发浓缩至100毫升，测定并计算样品液中总黄酮含量。重复3次取平均值。（4）乙醇浓度对金银花总黄酮提取率的影响。精精确称取10克金银花于回流瓶中，以固液比为1∶19，在65℃分别分别放于乙醇体积分数为50%、60%、70%、80%、90%回流3小时，放置冷却后过滤，滤渣在此条件下重复提取1次，然后将两次滤液合并，蒸浓缩至100毫升，测定并计算样品液中总黄酮含量。重复3次取平均值。

1.2.5 正交试验提取工艺优化 在乙醇法提取金银花黄酮过程中，对液固比、乙醇体积分数、提取时间、提取温度等影响因素进行正交试验。

1.2.6 金银花总黄酮的测定及含量计算 准确称取10毫升的金银花有机提取液置于50毫升容量瓶中，按芦丁显色标准方法测定金银花提取液在420纳米处测定吸光度，计算金银花提取物中总黄酮的含量。

2 结果与分析

2.1 总黄酮标准工作曲线

以芦丁标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制总黄酮标准工作曲线（见图1），得回归方程：Y=10.88X+0.0073，相关系数R2=0.996。结果表明，总黄酮含量在该范围内与吸光度线性良好。

2.2 金银花总黄酮的颜色反应

依据总黄酮的定性鉴定方法，含有黄酮类的物质在与盐酸—锌粉、硼酸溶液、氢氧化钠溶液、浓硫酸中反应，应分别显粉红色、无反应、黄色、橙红色（表1）。本试验金银花提取液的颜色反应结果与定性鉴定的颜色反应结果一致，确认金银花—乙醇的浓缩提取液中含有黃酮类物质。

2.3 单因素试验结果分析

由单因素试验结果分析发现各因素对金银花总黄酮含量影响程度不同。

2.3.1 固液比对金银花总黄酮提取率结果分析 由表2可知，固液比对金银花总黄酮提取率的影响，当用70%乙醇为有机溶剂提取金银花总黄酮时：随着固液比的增加，金银花中总黄酮的提取率先增加后下降，当固液比在1∶19时，金银花中总黄酮的提取率最佳，所以在该试验条件下固液比1∶19最为合适。

2.3.2 温度对金银花总黄酮提取率结果分析 提取温度对黄酮得率的影响如表3，在该试验条件下温度对金银花总黄酮的提取率先增加后减少，在65℃时金银花中总黄酮的提取率最高。

2.3.3 时间对金银花总黄酮提取率结果分析 其他条件不变的情况下，提取时间对金银花总黄酮提取率的影响结果见表4，提取时间在0～3小时时提取液中总黄酮类物质的浓度随时间增加而升高，在3小时时达到最高，即使增加时间浓度也不会提高，所以3小时是最佳的提取时间。

2.3.4 乙醇浓度对金银花总黄酮提取率结果分析 乙醇浓度对金银花总黄酮提取率的结果如表5，体积分数在70%之内随分数增加而增加，在70%达到最大浓度3.55%，体积分数超过70%以后即使增加浓度提取率也不会增加，所以在该试验条件下70%乙醇体积分数为最佳体积分数。

2.4 正交试验结果与分析

本试验对液固比A、乙醇浓度B、时间C、温度D均不同的正交试验，见表6和表7。

由表7正交试验结果可知，各种因素对金银花总黄酮含量提取率影响程度依次为A>B>C>D。依实验结果可看出，溶剂越多，提取率越高，但由于结果相近，越多的溶剂会造成资源的大量浪费。提取时间对提取率也有一定的影响，时间过短提取不充分，时间过长使得提取周期延长，而且长期处于高温状态可能造成黄酮被高温破坏，反而降低黄酮的提取率。所以由表分析结果中数据4种因素水平在A2、B2、C3、D1组合时为最佳提取条件，在该条件下提取液中黄酮含量最高，黄酮含量达到3.55%。

3 结论与讨论

用乙醇提取金银花总黄酮最佳提取条件为，固液比1∶19，乙醇体积分数70%，提取时间为3小时，提取温度为65℃，在该工艺条件下金银花黄酮含量为3.55%。在这些条件下，该有机溶剂提取工艺最优化，费用最低，提取溶剂使用量最少，提取物易收集，无污染，可实现工厂化生产，是提取金银花总黄酮的一种非常有效的方法。

目前对黄酮提取的研究基本技术有3种：水提法；溶剂提取法；超声波辅助法。如何将几种简单的方法配合使用获得更高的提取率是未来金银花黄酮类物质提取的研究方向。