原料牛奶中微生物的污染来源及检测方法

史群杰 张丽茹 谢春胜 黄新红 张东丽 张连潮

摘要：牛奶刚挤出时含有较少的微生物，但在不良因素的影响下，如时间的延长、环境变化以及管理不当等，会非常容易污染微生物，促使大量微生物繁殖，从而导致其酸度明显增高或者发生酸败等，造成牛奶质量严重下降，尤其是严重酸败时不允许用于加工乳制品。现介绍原料牛奶中微生物的来源及检测。

关键词：原料牛奶；微生物；污染来源；标准平板计数法；聚合酶链式反应；DNA探针技术

中图分类号：S81

文献标识码：B

文章编号：2095-9737（2018）01-0019-01

1 污染来源

乳房内的微生物。正常情况下，奶牛健康乳房中始终存在一些细菌，其通常会经由乳头管移动到乳池下部，再随着细菌自身的繁殖以及乳房的机械运动而移动到乳房内部。另外，由于乳头前端非常容易侵入外界环境中的细菌，因此最先挤出的少量牛奶中一般存在较多的细菌。一般来说，乳头管处的细菌数达到每毫升6000个左右，后面挤出的牛奶中所含的微生物数量逐渐减少，通常达到每毫升200 - 600个。但是当奶牛患有乳房炎后，因为感染病原微生物，会导致分泌牛奶中微生物水平显著升高。

挤奶过程污染微生物。牛体的污染，是指由于自身生活习惯，经常在泥泞或者存在较多粪便的地面上走动或者卧地休息，从而导致牛蹄、躯体容易黏附大量粪便、土壤以及饲料，而这些物质中都含有很多细菌，尤其是粪便作为大肠菌的主要来源。一般来说，不清洁牛体上黏附的尘埃中，每克含有几亿至几百亿个细菌；通常每克湿牛粪含有几十万至几亿个细菌，每克干牛粪则含有几亿至百亿个细菌。挤奶过程中，只要以上不洁物质落入牛奶中，就会产生严重影响。挤奶环境的污染，主要包括挤奶间的空气、浮尘和降尘，地面的清洁程度以及苍蝇、老鼠等病媒污染，都容易导致牛奶中微生物数量明显增加。挤奶员的污染，即经由挤奶员双手、衣服、头发、呼吸以及其他错误操作等而导致牛奶污染，从而导致其中所含的微生物数量增多。挤奶设备的污染，是指接触牛奶所有用具没有进行严格的清洗、消毒，往往会黏附较多微生物，這也是原料牛奶中微生物的一个重要来源。

储存、运输过程污染微生物以及繁殖。牛奶刚挤出时的温度一般为37—38℃，含水量为87%，加之富含营养，可作为大量细菌的繁殖培养基。尤其是当温度升高时，会促使细菌加速繁殖，同时造成牛奶变酸发生腐败。原料奶在运输过程中，如果运输容器不卫生，运输车没有保温设施而导致奶温度升高，以及剧烈震荡等，都会促使微生物加速繁殖，从而造成原料奶发生变质。

2 常用检测方法

标准平板计数法。取牛奶样品充分摇匀，接着添加适量的0.85%灭菌生理盐水制成10倍的样品均液备用。取1 mL 10倍的样品均液，沿着管壁缓慢注入添加有9 mL稀释洗液的无菌试管中，充分摇匀或者用灭菌吸管多次吹打，以促使样品充分混合，即为100倍的样品稀释液，并继续通过上述方法制备一系列的样品稀释均液。根据原来牛奶的污染程度，通常稀释到1000倍至10万倍即可。一般来说，原料牛奶选择2～3个适宜稀释度的样品匀液，在无菌平皿（也就是培养皿）内加入1 mL样品匀液，注意每个稀释度要接种两个平皿。同时，还要在两个灭菌的平皿内加入1 mL空白稀释液作为空白对照。然后及时向添加有样品稀释液的平皿内倒入18 mL已经冷却至46℃左右的平板计数琼脂培养基，接着轻轻转动平板，当凝固后翻转平板写上样品编号。凝固后的全部培养皿都放在恒温培养箱（35—37℃）中进行48 h培养。最后将培养皿全部取出，计算长出的菌落总数，并在相应样品稀释度上记录。

PCR技术。即聚合酶链式反应，是一种体外快速扩增核酸的方法，其能够在几小时之内就让原来极微量的核酸扩增达到数百万倍以上。一般来说，只要选择适宜的引物，PCR技术就能够特异性地促使某- DNA片断大量扩增达到容易检测的水平。该技术的原理是根据DNA模板的特性，模仿其在动物体内的复制过程，在体外使用单链作为模板，通过人工合成引物以及耐热聚合酶的作用进行变性、退火、延伸，从而促使目的DNA序列大量扩增，最后再通过凝胶电泳技术对DNA片段的扩增产物进行检测。根据以上原理，能够经由特异性地扩增某种微生物的基因片断而达到快速检测的目的。相比于传统检测方法，PCR技术具有的最大优点是准确、快速，一般只需要几小时内就能够实现对微生物的鉴定，但该技术只能够在那些已知核酸序列的微生物的鉴定中应用。

DNA探针技术。DNA探针是一个被标记的较短的脱氧核糖核酸序列，其能够与从微生物中抽提出的DNA序列进行杂交或者互补配对，也就是以C-G、A-T的方式进行配对，从而形成双股DNA。如果DNA探针的基础序列能够互补于靶微生物特异性序列，则探针就只能够与靶微生物DNA相互结合。DNA探针一共分成两种类型，一种为无放射性标记的探针，另一种为含有放射性标记的探针。其中非放射性标记的核酸探针具有多种类型，生物素抗生物素蛋白系统标记是较为广泛应用的一种非放射性核酸探针；放射性标记的核酸探针具有非常强的特异性，相比于常规法检测病原微生物速度要明显加快。