一例猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型混合感染的实验室诊断

杨克礼 焦祖武 田永祥 周丹娜 段正赢 郭锐

摘要：2016年美国报道了一种新型病毒猪圆环病毒3型（Porcine Circovirus 3，PCV3）。随后，包括中国在内的许多国家报道了该病的流行。2018年4月，湖北省襄阳市某猪场送样品至本实验室检测。本实验室利用荧光定量逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcrlption Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）、一步法逆转录PCR（One Step Reverse Transcription PCR，One Step RT-PCR）及多重PCR方法分别检测了猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PorcineReproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）、PCV2及PCV3。结果CSFV、PRRSV均为阴性。PCV2、PCV3为阳性且存在混合感染现象。经采取综合防控措施后，本次疫情得到控制。

关键词：猪圆环病毒3型;猪圆环病毒2型;混合感染;一步法逆转录PCR

中图分类号：S855.3

文献标志码：A

文章编号：1001-0769（2018）10-0033-03

猪圆环病毒（Porcine Circovirus，PCV）在分类学上属圆环病毒科圆环病毒属，是目前己知的最小的动物病毒之一^[1]。病毒粒子直径14 nm～17 nm，呈20面体对称结构，无囊膜，含有共价闭合的单股环状负链DNA，基因组大小约为1.7 kb。2016年以前，在全球范围内仅发现PCV有PCV1和PCV2两个基因型^[2]。PCV1是猪肾细胞PK-15污染物，但不产生细胞病变效应，对猪无致病性。PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原，与猪皮炎与肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征、繁殖障碍、增生性坏死性肺炎和肠炎等疫病密切相关。PCV2感染一般不会直接引起猪的死亡，主要是引起猪体的免疫抑制^[3-4]。

2015年，美国首次报道发现一种新型的猪圆环病毒——PCV3，随后波兰、韩国、意大利和中国等国家均报道有PCV3的发生与流行^[5]。2016年以来，我国华中、华东、华南地区的十余个省份陆续报道该病的流行。PCV3可引起猪的皮炎、肾病综合征、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应，给全世界的生猪养殖造成了极大的经济损失^[6]。

由于PCV2能破坏猪体的免疫系统，造成免疫抑制，因而本病常与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PorcineReproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus，PRV）、猪肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌和链球菌等混合或继发感染^[7]。PCV3感染后，猪的临床表现与PCV2引起的症状极其相像。与PCV2类似，PCV3在临床上可单独存在，也可与其他病原混合感染^[8-9]。

2018年4月份，湖北省襄阳市某猪场部分保育猪出现持续性、反复性腹泻、发烧、气喘等症状，病猪消瘦，四肢前端、后背、臀部皮肤发绀，后背两侧皮肤有散在红色点状丘疹。经多种抗生素治疗未见好转。故于发病约10 d后送检2头发病濒死猪至本实验室进行病原检测。现将实验室检测结果报道如下。

1 材料与方法

1.1病料

发病濒临死亡保育猪2头，由湖北省襄阳市某猪场送至本实验室进行病原检测。

1.2检测所用试剂（盒）

Viral DNA/RNA Miniprep Kit （AxygenScientific）、Ex-Taq酶、Prime Script One StepRT-PCR Kit、DL 2000 Marker（Takara）、胶回收试剂盒（TIANGEN）和其他生化试剂（为国产分析纯，购自武汉某商业公司）。

1.3引物设计

猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）、PRRSV分别参照文献^[10-11]设计，PCV2、PCV3引物序列如下：

PCV2-F：5'-CACATCGAGAAAGCGAAAGGAAC-3'

PCV2-R：5'-TGCGGGCCAAAAAAGGTACAGTT-3'

PCV3-F：5'-AGTGCTCCCCATTGAACG-3'

PCV3-R：5'-CGACCAAATCCGGGTAAGC-3'

PCV2、PCV3预期产物大小分别为505 bp、1 007 bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4病毒检测

剖检濒死保育猪，取淋巴结、脾脏、肺脏、肾脏等组织，按1：5加入pH 7.2的磷酸缓冲盐溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）混合研磨，反复冻融3～5次，4℃12 000 r/min离心10 min～15 min;取上清液200 μL～400 μL用Viral DNA/RNA Miniprep Kit提取病毒核酸，根据病理剖检特征及送检要求，分别应用荧光定量逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase ChainReaction，RT-PCR）^[10]和一步法逆转录PCR（One StepReverse Transcription PCR， One Step RT-PCR）^[11]檢测CSFV、PRRSV，利用复合PCR方法检测PCV2和PCV3。荧光定量RT-PCR和One Step RT-PCR方法的反应体系及反应程序分别按对应文献进行;检测PCV2和PCV3的复合PCR方法按如下反应体系和循环参数进行：

总体积为50 μL的反应体系，包含10×PCRbuffer 5.0μL、10 mM dNTPs 4μL、10μM上下游引物各1μL、Ex-Taq（5 U/μL）0.5μL、模板DNA 5.0μL、dd H₂0补充至50μL。

循环参数95℃5 min，94℃40 s，56℃40 s，72℃1min，共35个循环;72℃延伸10 min。扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测并在凝胶成像系统中观察、拍照记录结果。

2 结果

2.1 CSFV检测结果

参照文献^[10]方法对2头保育猪淋巴结、脾脏、肺脏、肾脏等组织RNA进行荧光定量PCR检测，结果仅阳性对照产生了特异性荧光，其他所有样品及阴性对照均未见特异性荧光产生，即所有检测样品均为CSFV阴性（图1）。

2.2 PRRSV检测结果

参照文献^[11]方法对2头保育猪淋巴结、肺脏等组织RNA进行One Step RT-PCR检测，结果仅阳性对照产生了特异性目的条带，其他所有样品及阴性对照均无特异性目的条带产生，即所有检测样品均为PRRSV阴性（图2）。

2.3 PCV2、PCV3复合PCR检测结果

利用1.4病毒检测中的PCV2、PCV3检测引物，按照上述反应体系及循环参数进行复合PCR检测，结果8份样品中，2份肺组织和1份淋巴结组织PCV2、PCV3阳性，1份淋巴结组织和1份脾组织PCV3阳性，2份肾组织PCV2阳性，1份脾组织阴性（图3）。

综合上述实验室检测结果，确诊该病例为PCV3与PCV2的混合感染。

讨论

本次实验室检测根据送检要求及临床发病症状及病理剖检特征，分别对CSFV、PRRSV、PCV3和PCV2进行了检测，结果该场发病保育猪CSFV和PRRSV均为阴性，但存在PCV3和PCV2均为阳性且为双重感染病例。近年来，我国部分地区动物流行病学监测结果显示猪圆环病毒2型的感染率及其引起的猪圆环病毒病的暴发次数都有上升的趋势，且常与PRRSV、PRV和CSFV等混合感染，表现出较高的病死率，给养猪业造成了严重的经济损失^[12-14]。

自2016年美国首次在猪群中检测出PCV3以来，在我国包括湖北省、广东省、河北省及山东省等10多个省份均检测出有PCV3的存在^[15-17]。随着PCV3感染率和流行率的快速增长，引起了兽医及相关科研人员的广泛关注。临床上PCV2主要侵害哺乳仔豬、保育猪、育肥猪和怀孕母猪，引起的特征性临床症状为患猪体质不良、皮肤苍白，还可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征等多种表现各异的疫病^[18]。而PCV3初次发现时，感染PCV3的猪并没有呈现特征性临床特征，仅是利用组织切片观察到部分组织出现了病理变化^[19]。但这些症状和病理变化并不一定是猪感染PCV3后引起的特征性病变，加上PCV3分离培养难度较大，因此PCV3的预防和控制更加不易。

由于PCV2和PCV3均无有效药物进行治疗。因此，建议本病例采取综合防控措施。具体如下：（1）完善猪场的生物安全体系建设，猪场彻底消毒。最大限度地降低猪场内污染的病原微生物，杜绝猪群继发感染。（2）分群饲养，切勿将不同日龄的猪混群饲养，降低猪群之间PCV2和PCV3的接触感染机会。（3）提高猪群的营养水平。由于PCV2感染可以导致猪群的免疫功能下降，因此，提高猪群的蛋白质、氨基酸、维生素和微量元素等水平，提高饲料的质量，保证充足的饮水，可以降低PCV2的发病率。（4）加强管理，减少应激。（5）做好免疫预防。切实做好猪瘟、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪伪狂犬病等的免疫接种。也可以紧急接种猪圆环病毒灭活疫苗。（6）根据药敏试验结果，选择使用敏感药物，控制细菌的继发感染。通过约1周的实施后，猪场己无死亡病例发生，疫病得到控制。 由于PCV3的病原学特性、流行病学特点、致病机理尚不清楚，因此PCV2与PCV3混合感染病例中PCV3与PCV2如何引发机体致病的具体致病机理亦无法判断。本次检测结果表明，PCV3不仅在湖北省内有流行，且存在与PCV2的混合感染的现象，PCV3和PCV2今后在湖北省内的发展趋势及其对养猪业的具体危害，有待于进一步的研究。

（参考文献：19篇，略）