Small RNA高通量测序文库分选方法比较

张磊 张清华 杜安娜 闵娟 高丁

摘 要：对于常规small RNA测序，使用Bluepinpin全自动核酸电泳与片段回收系统对文库进行回收，安全，目前已被广大测序用户采纳，但费用相对较高；而传统的切胶回收方法，其使用的实验试剂对人体有危害，同时操作繁杂，耗时较长，但费用较低。作者发现某些特殊样品构建的文库使用两种回收方法获得的文库差异悬殊，这篇文章旨在对特殊样品的文库使用全自动回收仪和传统的切胶回收的方法进行比较。因此，在smallRNA文库回收时，需根据不同的实验材料与需求，选择最优的回收方案。

关键词：smallRNA；文库回收；分选方法

随着高通量测序的广泛应用，对测序文库质量的要求也越来越高，文库片段大小的分选则是文库制备中的关键步骤。传统的核酸片段回收的方法是利用切胶回收，该方法比较繁琐，且操作过程中使用到的部分试剂对人体有毒性。因此，自动化完成核酸片段回收的需求越来越强烈。Sage Science公司由此开发出了 Pippin Prep（Bluepinpin） 全自动核酸电泳与片段回收系统，高质量的完成包括建库在内的多种实验过程中分离纯化各种大小 DNA 片段的需求。精确的片段回收对于优化高通量测序效率、提高基因组组装成功率和降低测序运行成本均具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 仪器和材料

Bluepinpin 全自动核酸电泳与片段回收系统（ Sage Science）、3% Agarose Gel Cassettes， Dye-free（ Sage Science） 、安捷伦2100生物分析仪、安捷伦High Sensitivity DNA Kit （ Agilent ）、Novex TBE gels， 6%， 10 well （ Life Technology ）、Novex TBE running buffer （ 5× ） （ Invitrogen ）。

1.2 样品前处理

根据特定的实验目的，对样品进行前处理，将病毒接种细胞后进行分离培养，使用常规的方法提取病毒Total RNA，再加入相应的抗体、RNase、Proteinse K、酚、氯仿等一系列的处理，再使用无水乙醇/乙酸钠/Glycogen沉淀，置于-80℃冰箱保存。

1.3 Small RNA文库构建及回收

将沉淀下来的Total RNA用无酶水溶解，使用Illumina small RNA library prepare kit（ REF： 15016911），按照操作说明构建small RNA 文库。对构建好的文库分别进行切胶回收和使用Bluepinpin 全自动核酸电泳与片段回收系统进行回收。

1.4 对回收前和回收后的文庫进行质检

利用qubit 3.0对构建好的文库进行定量，再分别对使用两种方法回收的文库进行定量，比较两种方法的回收效率。同时，使用安捷伦2100核酸检测仪进行片段大小的检测，以检测回收的片段大小范围是否符合实验要求，并比较两种方法对片段大小的分选能力。

2 结果与分析

对回收前和回收后的Small RNA文库进行浓度检测。使用qubit3.0检测回收前，体积为30 uL，浓度为68.2 ng/uL；切胶回收后体积为30 uL，浓度为46.6 ng/uL，回收率为68.33%；使用Bluepinpin回收系统回收后体积为30 uL，浓度为1.58 ng/uL，回收率为2.32%。由此可见，两种回收方法差异极为显著。

对回收前和回收后的Small RNA文库进行片段大小检测。结果如右图所示。（图1、图2、图3）

结果显示，切胶回收比使用Bluepinpin回收系统回收效果好，回收效率更高，片段分选更精确，且能达到上机测序的要求。

3 讨论

对于该实验中使用的测序建库材料，由于其特殊的实验目的，建库前进行了相关的抗体处理，并在核酸溶解时加入糖原，这些抗体和糖原在建库时被引入，并有可能一直存在于构建好的文库中。而Bluepinpin回收系统回收时要求核酸中无任何蛋白、盐离子等杂质，此文库中存在的抗体和糖原可能严重的影响了Bluepinpin回收系统识别文库中核酸片段大小的能力，从而导致回收效率低下，且片段大小杂乱无章，无法准确回收目的片段。因此，对于此类样品，必须采用传统的切胶方法回收方可回收到目的片段。

4 致谢

感谢中科院武汉病毒研究所公共技术服务中心张配和许碧超提供的实验方面的帮助。