大豆异黄酮检测方法的优化

徐佳璐

摘要：本文研究使用高效液相色谱仪对大豆中常见的四种异黄酮进行同时检测的最佳色谱条件为：选取碳18色谱柱进行检测，选取乙酸水溶液（0.1%）为流动相A，选取乙酸甲醇溶液（0.1%）为流动相B，以0.8 mL/min的流速依次进行梯度洗脱。设定检测波长为260 nm，在此条件下待测组分都能够达到比较理想的分离，计算所得的线性相关系数（R2）为大豆甙R2 =0. 9996、染料木甙R2一0. 9995、大豆苷元R2 =0. 9997、染料木素R2 =0. 9993，线性表现良好。

关键词：大豆；异黄酮检测；高效液相色谱

中图分类号：S5 65.1

文献标识码：B

文章编号：2095-9737（2018）03-0011-01

1 流动相选择

国标方法当中选用的流动相为乙腈，乙腈的毒性较大。根据乙腈的极性较强的特点，实验中也使用强极性的流动相进行代替。为了在更短的时间内达到洗脱效果，本实验选用了甲醇作为乙腈的替代品，采用不同浓度的甲醇水溶液及甲醇乙酸溶液作为流动相进行检测，寻找合适的洗脱剂，使得各组分得到快速有效的分离。

2 流速选择及梯度洗脱方案设计

流動相的流速对组分的分离效果，分离时间以及峰形都有较大的影响。流动速度加快洗脱速度，缩短洗脱时间，加快试验速度，会使峰形变窄，但同时会使得峰与峰之间的距离缩短，流动相流动速度太快会使得组分分离不完全，但是流动相流速过快又会使得实验时间加长，峰宽变大。本实验中通过对流动相A和流动相B的流速进行调整，在不同的阶段采用不同的流速，以求用最短的洗脱时间，达到最佳的分离效果。

3 实验方法步骤

3.1 仪器和试剂

高效液相色谱；分析天平（0.OO01 g）；四种大豆异黄酮标准品（大豆甙、染料木甙、大豆苷元、染料木素）；甲醇（色谱纯）；乙酸（色谱纯）；一级实验用水。

3.2 标准溶液配置

用分析天平（0.OO01 g）分别准确称取四种大豆异黄酮标准品，并用甲醇水溶液（浓度为60%）配成标准储备液（浓度为1 mg/mL）。用单标式移液管分别准确吸取四种标准储备液于50 mL容量瓶中配置标准序列溶液，浓度分别为Oμg/mL、10.Oμ/g/mL、20.Oμg/mL、40.Oμg/mL、80.Oμg/mL、200.Oμg/mL。

3.3 实验方案设计

流动相浓度：选取乙酸水溶液为流动相A，选取乙酸甲醇溶液为流动相B，分别配置浓度均为0.1%、0.2%、0.3%的流动相A、B；

流动相流速：分别采取0.4 mL/min、0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.O mL/min的流速进行实验；

梯度洗脱方案：设定流动相A和流动相B的比例：分别采取O min（50： 50），6 min（55： 45），12 min（75： 25），15 min（50：50）四个时间梯度；O min（50：50），6 min（550：45），10 min（70：30），12 min（75：25），15 min（50：50）五个时间梯度；O min（ 50： 50），4 min （55： 45），6 min（ 65： 35），10 min（70：30），12 min（75：25），15 min（50：50）六个时间梯度，分别采用三个方案进行实验。

实验条件：选用安捷伦碳18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温为25℃；进样量为10 μL；检测波长为260 nm；分别采用不同的流动相，不同的流动相速度以及采用不同的梯度洗脱方案进行实验。每组实验进行五次平行实验，选取最优的效果进行比较讨论。

3.4 标准曲线绘制

分别以每组实验测得的四个组分的峰面积为纵坐标，以对应的标准序列溶液浓度为横坐标，进行线性回归计算，分别得到四种选取的大豆异黄酮检测的标准曲线方程，并分别计算其线性相关系数R2。

3.5 回收率实验

用单标线移液管分别准确吸取四种大豆异黄酮标准储备液5 mL，6 mL、8 mL用甲醇水溶液（浓度为60%）定容至10 mL，用优化后的条件进行检测，计算所得浓度，每个样品做两次平行实验，计算本方法的回收率以评价方法的准确性。

4 数据及讨论

通过计算几组实验的相关系数可知，以乙酸水溶液（0.1%）为流动相A，以乙酸甲醇溶液（0.1%）为流动相B，流速为0.8 mL/min，选择五个时间梯度，在260 nm波长下进行检测时得到的线性相关系数最好，大豆甙R2=0. 9996、染料木甙R2=0. 9995、大豆苷元R2=0. 9997、染料木素R2-0. 9993。因此在此条件下四种待测组分均达到了理想的的基线分离，四种异黄酮的峰能够完全分离，且全部具有理想的谱峰形态。回收率实验中四种组分的回收率分别为92%—103%、94% -105%、91% -102%、89% -107%，根据《中国药品检验标准操作规程》有关规定，高效液相检测方法的平均加样回收率控制在80%—120%之间，均在误差允许范围内。

5 结论

本实验经过优化后能够在15 min内完成，并且根据线性相关系数和回收率实验可以看出，本实验所采用的检测大豆异黄酮各个组分的方法能够做到准确、快速定量。