拟除虫菊酯类杀虫剂对赤拟谷盗CYP4基因的诱导表达特性

梁晓 伍春玲 陈青 徐雪莲

摘 要 昆虫细胞色素P450的CYP4家族基因是在杀虫剂诱导表达和抗药性研究方面涉及最多的基因家族之一。拟除虫菊酯类杀虫剂是防治赤拟谷盗的常用药剂，当前已有较多抗药性相关报道，但尚缺乏多个拟除虫菊酯农药对赤拟谷盗CYP4家族P450基因诱导表达特性的研究。本研究首先选取4个赤拟谷盗CYP4家族P450基因CYP4G7、CYP4G14、CYP4BR1和CYP4BR3，然后用氯氰菊酯、氟氯氰菊酯和氯菊酯分别以不同浓度和时间处理20 d幼虫，并采用荧光定量PCR分析P450基因的诱导表达特性。结果表明，4个P450候选基因中仅有CYP4G7不仅可以被供试的3种菊酯类药剂显著诱导，并且LC20处理24 h和1/4 LC20处理6 h两种处理浓度对CYP4G7的诱导水平无显著差异。本研究结果表明亚致死剂量拟除虫菊酯类杀虫剂6 h处理即可导致赤拟谷盗CYP4家族P450基因表达量的显著提高，为延缓上述3种杀虫剂抗药性合理防治赤拟谷盗提供理论依据。

关键词 拟除虫菊酯农药；赤拟谷盗；P450基因；CYP4家族；诱导特性

中图分类号 S433.1 文献标识码 A

Abstract Cytochrome P450 gene from CYP4 family is one of the most important gene family which is related to xenobiotic-triggered induction and insecticide resistance. Pyrethroids are the common insecticides applied in the control of the red flour beetle， Tribolium castaneum， and there are several resistance cases reported up to now. However， there are lack of studies regarding the induction of P450 genes from CYP4 family in T. castaneum when treated by different pyrethroid insecticides. In this study， four P450 genes CYP4G7， CYP4G14， CYP4BR1 and CYP4BR3 from 20-d larvae were selected as the candidate genes for the analysis of the transcription when treated by cypermethrin， lambda-cyhalothrin and permethrin respectively. The results showed that among the candidate P450 genes only CYP4G7 could be significantly induced by all the pyrethroids， moreover， the transcription of CYP4G7 under treatment of LC20 for 24 h showed no significant difference when compared to the treatment of 1/4 LC20 for 6 h. The study demonstrated that the induction of CYP4G7 was rapid and only required subletheal concentrations， which could provide a theoretical basis for T. castaneum control and delay the development of resistance to those three pyrethroid insecticides.

Keywords pyrethroid insecticides； Tribolium castaneum； cytochrome P450； CYP4 family； induction pattern

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.021

随着拟除虫菊酯类杀虫剂在害虫防治中的广泛应用，害虫对此类杀虫剂产生抗性的报道越来越多，其中以代谢抗性机制的研究较为普遍。昆虫体内细胞色素P450酶（P450s）、羧酸酯酶（CarE）及谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）这3类解毒酶的活性及相关基因表达量的异常变化是昆虫对拟除虫菊酯类杀虫剂产生代谢抗性的主要原因[1]，这3类解毒基因又以P450s家族类型最多，数量最为庞大。近年来许多研究表明，仅仅单个P450基因的表达量显著升高就可导致害虫对拟除虫菊酯类农药的抗性的显著增加，例如，抗溴氰菊酯油菜花露尾甲（Meligethes aeneus）幼虫和成虫体内CYP6BQ23表达水平比敏感品系提高多达900倍[2]；抗溴氰菊酯赤拟谷盗体内CYP6BQ9基因表达水平比敏感品系提高200多倍[3]；CYP6P4?[4]、CYP6P12[5]、CYP6Z1[6]和CYP9A[7]的过表达是阿拉伯按蚊（Anopheles arabiensis）、白纹伊纹（Aedes albopictus）、不吉按蚊（Anopheles funestus）、东亚飞蝗（Locusta migratoria）对拟除虫菊酯杀虫剂产生抗性的重要原因。

赤拟谷盗[Tribolium castaneum （Georgia）]是为害严重的世界性储粮害虫[8-9]，拟除虫菊酯类农药依然是赤拟谷盗药剂防治过程中使用较多的杀虫剂类型。研究表明，拟除虫菊酯农药处理可以诱导害虫多个P450基因表达水平的显著提高[10]，并且与P450s相关的拟除虫菊酯农药代谢抗性机理，也往往涉及来自不同家族的多个P450基因[11]。当前关于P450s诱导表达或抗性相关研究中，CYP4家族是报道较多的基因家族，该家族P450基因在拟除虫菊酯胁迫下的诱导表达在德国小蠊[12]、埃及伊蚊[10]、致倦库蚊[13]、棉铃虫[14]等害虫研究中得到阐释。然而一方面，国内外尚缺乏同类药剂不同品种处理下害虫P450基因诱导表达的相关报道；另一方面，当前菊酯类杀虫剂处理下赤拟谷盗CYP4家族基因的诱导表达情况尚不清楚。因此，本研究首先通过生物信息学分析从赤拟谷盗CYP4家族所有P450基因中选取若干个可能被诱导的候选基因，然后通过不同菊酯类农药处理确定能够被诱导的基因，并进一步分析不同浓度，不同时间处理下这些P450基因的诱导模式，以期为合理使用拟除虫菊酯类杀虫剂防治赤擬谷盗，延缓其抗性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试虫源 赤拟谷盗为堪萨斯州立大学（Kansas State University）昆虫系实验室饲养的Georgia-1（GA-1）品系。赤拟谷盗饲养参照肖达[15]的方法进行。

1.1.2 供试药剂 氯氰菊酯（98%）、λ-三氟氯氰菊酯（96.8%）和氯菊酯（97.5%）标准品购自Chem Service（West Chester，PA）。cDNA第一链合成试剂盒，Maxima? SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒均为Fermentas公司产品（Fermentas， Glen Burnie，MD）。其他所需缓冲液均按照《分子克隆实验指南（第3版）》配制。

1.2 方法

1.2.1 可被不同菊酯类农药诱导的候选P450基因的选择 选择赤拟谷盗CYP4家族所有的P450基因，以及其他昆虫来源的CYP4家族的P450基因（在外源化合物诱导或者抗药性方面功能已知，具体信息参见表1）构建系统发育树。P450基因氨基酸序列由美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）得来。不同的P450基因采用Mega 5.0软件的CLustalW模块进行氨基酸序列比对，并采用邻接法（neighbor-joining）构建系统发育树。与其他昆虫功能已知的P450基因聚类于同一分支的赤拟谷盗P450基因将作为被不同菊酯类农药诱导的候选基因进行下一步研究。

1.2.2 赤拟谷盗的生物测定方法 将0.5 mL系列浓度的农药（丙酮配制）加入20 mL的玻璃小瓶中，往玻璃小瓶内通氮气直至丙酮完全挥发（对照为0.5 mL丙酮）；氯氰菊酯和三氟氯氰菊酯设置的浓度梯度均为：CK（0）、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25 μg/mL；氯菊酯设置的浓度梯度为CK（0）、6.25、12.5、25、50、75、100、200 μg/mL；將20 d赤拟谷盗幼虫放入上述用药处理过的玻璃瓶中，并于培养箱中饲养24 h（30 ℃，65%湿度），每个处理浓度（包括对照）设置3个重复，每个重复15头幼虫；记录各个处理浓度下的幼虫死亡数，用SAS 9.1.3进行数据处理。

1.2.3 qRT-PCR测定方法 赤拟谷盗总RNA的提取参照RNA提取试剂盒进行。采用2.0 μg RNA（DNAase去除基因组DNA）用于cDNA的合成。cDNA样品经nuclear-free水稀释8倍后作为荧光定量PCR的模板。qRT-PCR反应条件为：95 ℃预变性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，40个循环。qPCR的引物设计用Beacon Designer 7.0软件设计。内参基因采用赤拟谷盗在不同龄期和组织中均稳定表达的ribosomal protein S3（TcRps3）基因来设计[16]。引物信息如表2所示。

1.2.4 拟除虫菊酯类农药对赤拟谷盗CYP4家族P450s的诱导表达测定 以不同菊酯类农药的LC20处理赤拟谷盗20 d幼虫，处理方法同生物测定，每个浓度（包括对照）设置3个重复，每个重复15头幼虫。24 h后每个重复取存活幼虫4头提取RNA，通过qRT-PCR测定分析候选P450基因的诱导表达情况。

1.2.5 不同拟除虫菊酯农药对赤拟谷盗CYP4家族P450基因的诱导模式 为比较不同处理浓度和处理时间对CYP4家族P450基因诱导表达的影响，同时减少实验处理，先以氯氰菊酯为处理药剂，比较LC20以及1/4 LC20两个不同浓度处理时赤拟谷盗P450基因的诱导情况，确定1/4 LC20也能诱导P450s表达后，再分别比较该浓度处理6、12、24、48 h对表达量的影响，确定能够诱导的最短时间。随后将最终确定的氯氰菊酯的浓度设置方法和时间分别应用于其他菊酯类农药，进一步评价P450基因的诱导表达情况。实验操作参照生物测定方法，每个处理3个重复，每个重复15头幼虫。

1.3 数据分析

生物测定时LC50、LC20、卡方值（χ2）等参数的计算采用SAS软件（SAS 9.1.3，SAS Institute Inc. USA，1996）进行。显著性差异分析采用Students t-test方法以及One-Way ANOVA-Fisher中的LSD方法，所有数据均为3个生物学重复的平均值±标准误（ ±SE），显著性检测水平为α=0.05。

2 结果与分析

2.1 拟除虫菊酯农药诱导相关的赤拟谷盗CYP4家族P450基因分析

图1结果表明，尽管用于构建系统发育树的赤拟谷盗CYP4家族P450基因多达25个，但大部分P450基因倾向于在某一个亚家族内聚类（如CYP4B和CYP4Q亚家族），而仅有CY4BR1、CYP4BR3、CYP4G7和CYP4G14这4个基因能够与其他昆虫来源的，在外源化合物诱导和抗药性方面功能已知的P450基因聚集于同一分支，表明这些基因的相似度较高，在功能上可能也有相似之处，因此最终选择这4个P450基因作为候选基因进一步研究不同菊酯农药处理时的诱导表达情况。

2.2 不同拟除虫菊酯农药对赤拟谷盗的毒力

由表3生物测定结果可知，赤拟谷盗20 d幼虫对农药的敏感性顺序为：氟氯氰菊酯>氯氰菊酯>氯菊酯，3种药剂的LC50分别为4.24、7.77、77.46 μg/mL。最终以3种药剂的LC20测定分析药剂处理下赤拟谷盗P450基因的诱导情况，具体的处理浓度分别为：三氟氯氰菊酯（2 μg/mL）、氯氰菊酯（2 μg/mL）、氯菊酯（16 μg/mL）。

2.3 不同拟除虫菊酯农药处理对赤拟谷盗P450基因的诱导表达特性

由图2可知，氯氰菊酯、氟氯氰菊酯和氯菊酯分别以LC20浓度处理赤拟谷盗20 d幼虫时，仅有CYP4G7能同时被供试的3种药剂显著诱导（p<0.05），诱导上调倍数分别为1.97、1.73和2.00倍，而其余P450基因在药剂处理前后表达量并无显著差异（p<0.05）。

2.4 拟除虫菊酯类农药对赤拟谷盗CYP4家族P450基因的诱导模式

图3结果表明，LC20和1/4 LC20浓度处理都能够诱导CYP4G7基因的显著上调（p<0.05），

并且表达量提高倍数无显著差异（p<0.05）。进一步比较亚致死剂量，即1/4 LC20（试虫24 h平均死亡率低于5%）处理不同时间对CYP4G7表达量变化趋势时发现，处理6 h表达量即可显著上调1.92倍，并在处理12 h（2.07倍）和24 h（1.89倍）后仍处在显著上升水平（p<0.05）；而处理48 h后虽然表达水平仍高于对照，但两者已无显著差异（p<0.05）。将上述处理条件（1/4 LC20，6 h）应用于所有菊酯农药，结果表明，对于任意一种菊酯农药，2种处理方式均可导致CYP4G7表達量的显著提高（图4），并且提高倍数无显著差异（p<0.05）。

3 讨论

昆虫细胞色素P450基因的诱导与药剂种类密切相关。首先，不同药剂诱导的P450基因有显著差别。例如，沙蚕毒素、二嗪农、虱螨脲和环虫腈处理均不能诱导任何P450基因表达，DDT仅能够诱导一个CYP12D1基因，而苯巴比妥处理可诱导十余个基因的表达[25]。其次，同一个P450基因能够被不同药剂诱导。例如，苯巴比妥和咖啡因处理均能显著诱导果蝇CYP4E2和CYP4E3的表达[17]，敌敌畏和溴氰菊酯均能够显著诱导家蚕CYP4M5基因，生物碱、尼古丁均能显著诱导烟草天蛾CYP4M1和CYP4M3基因[24]，再次，同种类型结构相似的杀虫剂往往可以诱导相同P450基因的表达，这在含氰基Ⅱ型拟除虫菊酯类农药（如溴氰菊酯、氯菊酯）对棉铃虫[26]、家蚕[27]和冈比亚按蚊[19]P450基因的诱导研究中均得到体现。本研究结果进一步补充了上述理论，候选的4个P450基因仅有CYP4G7均能够被上述3种菊酯类农药显著诱导，其余3个基因CYP4G14、CYP4BR1和CYP4BR3均不能被任何一种药剂诱导。然而，必须指出的是，本研究选择3种菊酯农药是在赤拟谷盗防治中应用较多的菊酯农药品种，但该类药剂种类繁多，结构差异大，因此本研究的实验结果虽然不能够完整反映该大类农药所有品种对赤拟谷盗P450基因的诱导表达情况，但却是对同类型农药诱导害虫P450基因的首次初探。

昆虫细胞色素P450基因的诱导随药剂处理浓度、时间和昆虫种类而变化。研究发现用苯巴比妥、咖啡因和DDT分别处理果蝇时发现，较低浓度的药剂处理即可显著诱导若干个P450基因的表达，并且表达量随着药剂处理浓度和时间的增加而逐渐增强[17]。李婷[28]通过分析嗜虫书虱的转录组，发现多数P450基因可被溴氰菊酯诱导上调，表达高峰多出现在药剂处理24 h后。针对小菜蛾的研究发现氯氰菊酯以亚致死剂量短时间处理能够比用高浓度（EC50或LC50）长时间处理对某些P450基因的诱导更显著，作者认为这可能与高浓度氯氰菊酯胁迫降低了害虫的应激反应能力有关[29]。刘月庆等[30]也研究发现溴氰菊酯只能在低剂量范围内（LD10）对甘蓝夜蛾CYP9A90基因发挥诱导作用，剂量过高（LD30和LD50）反而无诱导效果。相反地，Guo等[31]发现东亚飞蝗的CYP409A1和CYP408B1均可被不同浓度的（LD10、LD30和LD50）的溴氰菊酯所诱导。相似地，本研究结果显示，采用亚致死剂量短时间处理可以获得与LC20长时间处理相同的诱导效果，说明赤拟谷盗CYP4家族这几个P450基因可以被不同浓度的氯氰菊酯、氟氯氰菊酯和氯菊酯分别诱导。

研究害虫在杀虫剂胁迫下的诱导模式对于其抗药性的预测有重要参考价值。许多研究表明，容易被杀虫剂诱导的P450基因通常与抗性相关基因同属一个基因，这在埃及伊蚊-菊酯类农药（CYP6M11）[32]，小菜蛾-氯菊酯（CYP6BG1）[29]，果蝇-DDT（CYP6G1和CYP12D1）[33]的研究中得到体现。因此，当抗药性产生时，这些易于被诱导的P450基因可能作为潜在的抗性分子标记基因而被优先考虑。由于本研究发现不同的菊酯类农药低浓度处理均可显著诱导赤拟谷盗CYP4G7的表达量上调，因此长时间使用不同菊酯类农药防治赤拟谷盗产生交互抗性的风险较大，在实际生产中应注意该类药剂与其他药剂的轮换使用，以延缓抗性的产生。

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