拮抗内生细菌BEB17对4个香蕉品种组培杯苗的定殖、促生分析和抗病性评价

桑建伟 陈奕鹏 蔡吉苗 杨扬 徐春华 黄贵修

摘 要 BEB17是分離自健康香蕉根部的具有良好抑菌活性的内生解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。本研究采用直接灌根法，评价了该菌株对4个不同香蕉品种组培杯苗的促生作用和其对香蕉枯萎病菌（Fusarium. oxysporum f. sp. cubense race 4， Foc4）的防治效果。结果表明，经BEB17回接后的香蕉杯苗平均株高、叶片数和鲜重均显著优于对照，其中对南天黄品种的促生效果最好，株高增加48.24%，鲜重增加111.19%；带菌植株接种Foc4后，香蕉杯苗在发病率和病情指数上均显著低于对照，其中该菌株对南天黄和桂蕉1号的防治效果最明显，相对防效分别可达81.51%和77.46%。通过稀释平板涂布法，观察其在不同品种香蕉苗的定殖情况，发现BEB17能稳定定殖于4种香蕉品种，其中在南天黄的根部定殖10 d后定殖量最高，达6.43×104 CFU/g，在桂蕉1号定殖10 d和20 d后茎部和叶部定殖量达峰值，分别为1.58×103 CFU/g和1.43×103 CFU/g；品种比对发现菌株BEB17与南天黄和桂蕉1号的亲和性较强，定殖数量呈先升后降趋势。

关键词 内生细菌；促生作用；定殖分析；抗病性评价

中图分类号 S476 文献标识码 A

Abstract The strain BEB17 is an endophytic Bacillus amyloliquefaciens isolated from the roots of healthy banana with good antibacterial activity. In this study， the direct root irrigation was used to evaluate the growth promoting effect of the strain on four different banana cartivars and the effect on the control of banana fusarium wilt. The results showed that the average plant height， number of leaves and fresh weight of the banana cup seedings returned by BEB17 were significantly better than those of the control. Among them， the growth promoting effect of the Nantianhuang was the best， the plant height increased 48.24%， and the fresh weight increased 111.19%. After the banana cup seedlings transferred back to the strain BEB17 inoculated with banana fusarium wilt， the incidence and disease index of the banana cup seedlings were significantly lower than those of the control. Among them， the strain BEB17 had the most obvious effect on the control of the Nantianhuang and the Guijiao No.1， and the relative control effect was up to 81.51% and 77.46%. The colonization of different cartivars of banana plants was observed by dilution plate coating method. And we found the strain BEB17 could be stably colonized in the four banana cultivars. Among them， the highest colonization amount reached 6.43×104 CFU/g after 10 days of colonization in the roots of the Nantianhuang， the peak values of the colonization amount reached respectively 1.58×103 CFU/g and 1.43×103 CFU/g after 10 days and 20 days of colonization in the stem and leaf part of Guijiao No.1. The comparison of cartivars showed that strain BEB17 had stronger affinity with the Nantianhuang and the Guijiao No.1， and the number of colonization increased first and then decreased.

Keywords endophytic bacteria； growth promoting； colonization analysis； disease resistance evaluation

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.018

香蕉（Musa spp.）是一种极具营养价值的食用经济作物，广泛种植于世界热带、亚热带地区，是鲜果贸易量最大的水果之一[1]。由尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种（Fusarium. oxysporum f. sp. cubense race 4， Foc4）引起的香蕉枯萎病（又称巴拿马病）是一种侵染维管束导致香蕉植株枯萎死亡的毁灭性土传病害，已严重威胁着世界香蕉种植业的健康可持续发展[2]。近年来，由于化学药剂引起的药物残留、环境污染、破坏生态平衡等负面影响而令人担忧，从而使得利用有益微生物防治植物病害的研究越来越受到人们的重视。其中作为重要生防微生物资源的芽孢杆菌一直以来都是科研工作者关注的热点，解淀粉芽孢杆菌是芽孢杆菌中对植物病害具有重要防治作用的一个种，具有较好的抗逆性、根际定殖能力强、对自然环境安全、次生代谢产物多样、抑菌谱广、易于规模生产与管理等优点，是生物防治的重要微生物资源[3-4]。利用芽孢杆菌防治香蕉枯萎病已有大量研究报道，如朱森林等[5]从香蕉根部分离到的内生解淀粉芽孢杆菌BEB33，可产IAA促进香蕉植株生长，具有较好的生防潜力。孙正祥等[6]发现一株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）C-4，对香蕉枯萎病菌1号、4号小种的抑制率分别达81.25%和83.75%，盆栽实验发现该菌株对香蕉枯萎病具有良好的防效。黄霄等[7]分离鉴定了一株甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）BM-24，对香蕉枯萎病菌抑制效果达80%以上。

BEB17是分离自健康香蕉植株根部的一株内生解淀粉芽孢杆菌。前期研究发现，该菌株具有较强的广谱抑菌活性，其产生的多种挥发性抑菌物质、脂肽类化合物和聚酮类化合物等多种抗菌物质，能抑制尖孢镰刀菌Foc4的菌丝生长和孢子萌发（另文发表）。本研究通过分析内生解淀粉芽胞杆菌BEB17回接后对香蕉杯苗的促生长作用和抗病性评价，并研究其在这4个品种香蕉植株中的定殖情况，从而探究该菌株对香蕉枯萎病的生防潜力，为该菌株的进一步开发应用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 内生解淀粉芽孢杆菌BEB17、香蕉枯萎病病菌尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种菌株Foc4均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供。

1.1.2 供试香蕉品种 桂蕉1号和桂蕉9号均由广西壮族自治区农业科学院生物技术研究所提供，热科2号和南天黄均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供。所有供试香蕉苗均选用生长一致的四叶期组培杯苗。

1.1.3 培养基和试剂 LB和PDA培养基参照植病研究方法配制，分别用于细菌和真菌的培养[8]。真菌孢子悬浮液的制备参照朱森林等[5]方法：利用血球计数板将孢子悬浮液浓度调整至2×106 CFU/mL的分生孢子悬浮液备用。gyrB基因引物由华大基因股份有限公司合成，PCR扩增反应所需Taq酶、dNTP等试剂购于TaKaRa公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 拮抗内生细菌BEB17回接不同香蕉品种杯苗的促生作用测定 选取4种不同香蕉品种（热科2号、桂蕉9号、南天黄、桂蕉1号）沙床苗转入椰糠带土的杯苗中，除按常规肥水管理外，每隔10 d直接灌施BEB17菌液，菌液施用量按杯苗容积计算（浓度为1×106 CFU/mL，100 mL/杯），施用等量LB液体培养基为空白对照。施用菌液3次后，分别取施用内生菌液和LB液体培养基的不同品种香蕉杯苗各20株，于最后一次接种30 d后用卷尺测定香蕉苗株高，用天平称量香蕉苗鲜重，并对其新抽生叶片数进行计数。

1.2.2 拮抗内生细菌BEB17回接不同香蕉品种杯苗的抗病性评价 BEB17回接不同香蕉品种杯苗方法参照第1.2.1节。最后一次施用BEB17菌液10 d后，分别各取20株不同处理的香蕉品种杯苗，灌根法接种Foc4孢子悬浮液（浓度为1×106 CFU/mL，100 mL/杯），30 d后調查植株发病情况。统计发病率并参照病情指数分级标准[9]按以下公式计算病情指数和相对防效。

发病率（%）=枯萎病发病株/实验有效株×100%

病情指数=[Σ（各级病株数×该病级）]/（调查总株树×最高病级）×100

相对防效（%）=（对照病情指数–处理病情指数）/对照病情指数×100%

1.2.3 拮抗内生细菌BEB17回接不同香蕉品种杯苗的定殖情况 选取4种不同香蕉品种（热科2号、桂蕉9号、南天黄、桂蕉1号）沙床苗转入椰糠带土的杯苗中，采用直接灌根法将浓度为106 CFU/mL的BEB17菌液接种在不同香蕉品种杯苗中，以灌LB液体培养基的植株为空白对照。分别于接种后的5、10、15、20、25、30、35和40 d进行内生细菌的再分离，检测香蕉杯苗叶片、球茎和根部的内生细菌定殖情况。再分离方法采用三步消毒法，分别剪取香蕉苗的根、球茎和叶片组织各0.5 g，使用3.25%次氯酸钠消毒10 min，再用70%乙醇消毒3 min，然后用灭菌水清洗4次后，置于灭菌研钵中研磨。研磨过程中加少量石英砂，研磨均匀后加入5 mL灭菌水，得到浓度为51稀释液，再用无菌水梯度稀释至501、5001和50001。芽孢杆菌在温度高达120 ℃环境下仍能生长，故可采用85 ℃水浴10 min来杀死不含有芽孢的菌种，有助于快速筛选植株体内的芽孢杆菌[10]。水浴后吸取100 μL各梯度稀释液涂布于LB平板上，每个浓度3次重复，于28 ℃下培养2 d后，统计菌落数。同时对每个平板随机挑取2个菌落进行gyrB基因测序。

1.3 数据统计与分析

采用Excel 2010和SAS 9.1软件进行统计分析和差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 拮抗内生细菌BEB17回接不同香蕉品种杯苗的促生作用测定

由表1和图1可见，当灌施内生解淀粉芽孢杆菌BEB17菌液后，香蕉杯苗的株高、新抽生叶片数和鲜重均高于对照处理。总体来看，该菌株对不同品种香蕉苗形态指标的影响大小依次表现为：南天黃>桂蕉1号>热科2号>桂蕉9号。其中BEB17对南天黄植株影响最大，株高（31.65 cm）相对于空白处理（21.35 cm）增加了48.24%；鲜重（124.39 g）相对于空白对照（58.90 g）增加了111.19%。可见BEB17菌株发酵液可以促进香蕉苗的生长。

2.2 拮抗内生细菌BEB17回接不同香蕉品种杯苗的抗病性评价

由表2可知，接种菌株BEB17后均可提高这4个香蕉品种的相对防效，一定程度上降低了其病情指数。其中菌株BEB17对南天黄和桂蕉1号的防治效果最明显，其相对防效分别可达81.51%和77.46%，降低了发病率和病情指数，与未灌菌株BEB17的对照差异达显著水平。总体来看，该菌株回接不同品种香蕉苗对香蕉枯萎病菌的相对防效影响大小依次表现为：南天黄>桂蕉1号>热科2号>桂蕉9号。由此可见，BEB17菌株回接不同品种香蕉杯苗对香蕉枯萎病具有很好的防治作用。

2.3 拮抗内生细菌BEB17回接不同香蕉品种杯苗的定殖情况

从图2可以看出，菌株BEB17处理后，从不同香蕉品种的根、球茎和叶片中分离得到的内生细菌与内生细菌BEB17的菌落形态相似，单菌落呈圆形，边缘规则，有隆起，表面褶皱，不透明，表面干燥，菌落呈乳白色；然而对照组（菌株BEB17未处理）的根、球茎和叶片中分离得到的内生细菌数量少，菌落形态差异较大（图2）。从每个平板中随机挑取2个菌落进行gyrB基因测序，结果发现，菌株BEB17处理后，从不同香蕉品种的根、球茎和叶片中分离得到的内生细菌与内生细菌BEB17的gyrB基因相似性达100%，而原始菌株BEB17与对照组的根、球茎和叶片中分离的内生细菌gyrB基因差异大（图3）。说明处理回收的菌株主要是BEB17，而对照分离到的少量菌株不是BEB17。

通过菌株回收分离发现（图4），内生解淀粉芽孢杆菌BEB17均能在这4个香蕉品种的根、球茎和叶片内稳定定殖（图中定殖量的对数值为零时表示未检测到芽孢杆菌）。其中，在不同香蕉器官中根部更利于菌株BEB17的定殖，叶片部位次之。

图4-A显示，在接种内生细菌后，BEB17可稳定定殖于不同品种香蕉苗的根部，定殖量呈先升后降趋势，其中南天黄和桂蕉9号根部的定殖量在接种后10 d时达到最大值（6.43×104 CFU/g和4.34×104 CFU/g），热科2号在接种后20 d时达到最大值（3.57×104 CFU/g），桂蕉1号在接种后25 d时达到最大值（2.23×104 CFU/g）；图4-B显示，在接种内生细菌后，菌株BEB17在不同品种香蕉苗球茎的定殖量呈起伏状态，其中南天黄在接种后5 d球茎的定殖量达到峰值（2.15×102 CFU/g），在接种后15 d时热科2号和桂蕉1号的球茎定殖量达峰值（1.08×102 CFU/g和1.58×103 CFU/g），接种25 d后桂蕉9号球茎定殖量达峰值（1.32×102 CFU/g）；图4-C显示，在不同品种香蕉苗的叶片中内生细菌BEB17可稳定定殖，其中热科2号叶片中的定殖量在接种10 d时达到最大值（1.34×103 CFU/g），在接种15 d时南天黄和桂蕉9号叶片的定殖量达到峰值（2.95×102 CFU/g 和1.36×103 CFU/g），在接种20 d时桂蕉1号达到最大值（1.43× 103 CFU/g）。实验结果表明，内生解淀粉芽孢杆菌BEB17在不同品种香蕉苗中具有不同的亲和性，甚至在不同香蕉器官中的定殖规律亦存在着显著差异。

3 讨论

芽孢杆菌因其生长速度快、营养需求简单、抑菌谱广，具有较好的抗逆性和易于在植物体表面定殖与繁殖等优点而被广泛地应用于植物病害的防控以及植物生长的促进，因此其已成为生物防治领域研究的热点之一[4]。目前研究表明，芽孢杆菌对黄瓜、香蕉、棉花、玉米及番茄等多种植物病害都有着明显的防治效果。高吉坤[11]筛选获得的枯草芽孢杆菌B29对多种植物病害的致病菌都具有较强抑制作用，其中对黄瓜枯萎病的抗病率可达到90%以上。谢兰芬等[12]研究表明，解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2对多种病原真菌的孢子萌发均具有显著抑制效果，尤其在温室和田间具有较好的防效。杨晓云等[13]和蒋盼盼等[14]研究发现解淀粉芽孢杆菌B1619不仅对设施番茄枯萎病及设施蔬菜的根结线虫病具有较强的防治效果，而且对番茄生长具有显著促生作用。本研究发现，解淀粉芽孢杆菌BEB17能够有效降低南天黄和桂蕉1号这2个品种香蕉枯萎病的发病率，其相对防效分别可达81.51%和77.46%；并对不同香蕉品种植株均具有良好的促生长效果，尤其对桂蕉1号和南天黄植株的影响较大，其中对植株鲜重的促生长较为显著，说明该菌株在促进香蕉植株健壮和增重以及提高对香蕉枯萎病抗性具有良好的生防效果。

解淀粉芽孢杆菌大多存在于植株体内，因其对多种植物病害具有极好的防治效果和对寄主植物具有较好的促生作用而被开发成生物肥料等产品已在农业生产中广泛应用。然而在内生细菌的应用过程中，能否在植株体内有效定殖是其发挥防控效果的前提和关键因素[15]。目前，在玉米[16-17]、小麦[18]、烟草[19]、山茶[20]等植物上对解淀粉芽孢杆菌的定殖情况均有研究报道。本研究发现，内生解淀粉芽孢杆菌BEB17能够在不同品种香蕉苗中长期定殖，尤其在桂蕉1号和南天黄品种中大量定殖，其中在香蕉苗的根部组织定殖数量最多；在其球茎上的定殖数量较少，难以长期大量定殖；而在叶片上的定殖量比其球茎的较高，可长期定殖，该结果与前人的报道基本吻合[21-22]。该菌株在不同品种香蕉苗中的定殖数量存在着差异，其中根部最大定殖量：南天黄>桂蕉9号>热科2号>桂蕉1号，且南天黄根部定殖量达到最大值的速度最快，而防效与根部定殖量关系较大，从初步分析结果看该菌株与南天黄品种结合防效效果最好。从定殖结果来看，该菌株在香蕉苗球茎上定殖效果不佳，其原因可能与不同器官生境不同有关，BEB17可能对根部和叶片的生存环境更适应。

綜上所述，本研究采用直接灌根法研究发现内生解淀粉芽孢杆菌BEB17可以促进不同品种香蕉苗的生长，对香蕉枯萎病菌具有良好的防治效果；采用稀释平板涂布法研究证明该菌株能有效在不同品种香蕉植株中定殖，主要定殖发生在根部。通过上述研究，为菌株BEB17的定殖特征和生防机制的了解提供了理论基础，并进一步为研究植物-病原菌-内生细菌三者之间的互作关系奠定了基础。但关于该菌株对大田香蕉植株的促生长和抗性效果不明，回接大田香蕉植株的时效也有待进一步研究与摸索。

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