温郁金白绢病菌的生物学特性及药剂毒力测定

2018-05-14马瑞徐刚郑樊郑妃庆谢昌平

热带作物学报 2018年7期

马瑞徐刚郑樊郑妃庆谢昌平

摘要为明确温郁金白绢病菌（Sclerotium rolfsii）的生物学特性及对杀菌剂的敏感性，本实验研究了不同培养条件对病原菌菌丝生长和菌核形成的影响，并测定了10种杀菌剂对病原菌的抑制作用。结果表明，该菌菌丝生长和菌核形成的最适温度范围为30～32 ℃，适宜pH范围为5～7，适宜培养基为燕麦和玉米培养基；持续黑暗有利于菌丝生长，光暗交替有利于菌核形成；不同碳源和氮源对菌丝生长和菌核形成的影响差异显著，其中蔗糖和硝酸钠分别为最适碳源和氮源；菌丝和菌核致死温度分别为50 ℃和55 ℃。烯唑醇对该菌的抑制作用最强，EC50为0.141 2 mg/L；其次是吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑和氟硅唑；而代森锌和百菌清的抑制作用最差，不适合用于防治温郁金白绢病。

关键词温郁金；白绢病；齐整小核菌；生物学特性；毒力

中图分类号 S435.4 文献标识码 A

Abstract To clarify the biological characteristics and sensitivity to different fungicides， the effects of different culture condition on the hyphal growth and sclerotia formation of Sclerotium rolfsii were determined， and the inhibitory activities of ten fungicides on S. rolfsii were also studied. The results showed that the opitimum temperature was 30～32 ℃， the suitable pH was 5～7， oat and corn medium were the appropriate medium for hyphal growth and sclerotia formation. Continuous darkness condition was beneficial to hyphal growth， while the alternation of light and darkness was conducive to sclerotia formation. Effects for carbon and nitrogen sources on hyphal growth and sclerotia formation were significantly different， the optimal carbon and nitrogen source were sucrose and sodium nitrate， respectively. The lethal temperature of hyphal and sclerotia were 50 ℃ and 55 ℃， correspondingly. The toxicity test showed that diniconazole had the best inhibitory activity with EC50 of 0.141 2 mg/L among all fungicides， followed by pyrazole-kresoxim-methyl， difenoconazole and flusilazole. The inhibitory activities of zineb and chlorothalonil were lower and not suitable for controlling Curcuma wenyujin southern blight.

Keywords Curcuma wenyujin； southern blight； Sclerotium rolfsii； biological characteristics； toxicity

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.022

温郁金（Curcuma wenyujin Y. H. Chen et C. Ling）是我国应用最广的姜科药用植物之一，也是著名的“浙八味”之一，在我国已有1 000多年的种植历史，原产于浙江瑞安[1-3]，近年来在江西、福建、海南、贵州等地区均有栽培，全国种植面积超过1 333 hm2[4]，其药用价值巨大，根茎中所含挥发油和姜黄素类化合物可以有效预防和治疗癌症，除此之外，温郁金源药材在保肝、抗氧化、抗炎症等方面也有着良好的疗效[5-7]。

海南省于1997年开始引进种植温郁金，先后在海口市、澄迈县和临高县建立了温郁金种植基地，但由于温郁金栽培年限较短和对环境的适应能力不强，病害问题已成为制约海南省温郁金产业发展的一个重要因素。2016年11月笔者在田间调查中发现，一种温郁金新病害白绢病尤为严重，该病害主要为害近地面的茎基部和叶鞘，发病植株茎基部皮层腐烂，表面覆盖白色绢丝状菌丝层及白色至茶褐色菌核，叶片变黄凋萎，严重时全株萎蔫枯死。该病害发病速度快，蔓延迅速，重病区发病率高达90%以上，严重影响了温郁金的产量和药理品质，造成了巨大的经济损失。采集具有典型发病症状的温郁金茎部，经过病原菌的分离、纯化和致病性测定，得到温郁金白绢病菌株JN0610，观察菌落的培养特性、菌丝和菌核的形态特征，结合ITS基因测定结果将病原菌鉴定为齐整小核菌（Sclerotium rolfsii Sacc.）[8]。

齐整小核菌属于土传性真菌，寄主范圍很广，可侵染农作物、园艺作物、杂草和森林树木等[9]，目前在烟草、花生、芝麻和药用植物上相关报道较多[10-19]。为进一步了解温郁金白绢病的发生发展规律，扩大防治药剂的选择范围，本文对病原菌的生物学特性及多种高效杀菌剂的毒力进行了测定，以期通过调控环境条件降低病害的发生途径，同时为病害综合防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌种：2016年11月分离自海南省海口市琼山区红旗镇的温郁金种植基地中感病温郁金茎基部，由本实验室4 ℃低温保存备用。

1.2 方法

1.2.1 生物学特性测定

（1）温度对病原菌生长及菌核形成的影响在PDA平板上接种5 mm直径的病原菌，30 ℃培养2 d后，用内径5 mm的打孔器从菌落边缘切取菌饼，接于PDA培养基平板中央，将PDA平板分别放置于15、20、25、28、30、32、35、40 ℃温度梯度下的培养箱中黑暗培养，每处理设3次重复。2 d后用十字交叉法测量菌落直径，并计算3次重复的平均值，平均值减去5 mm作为病原菌实际生长的菌落直径。15 d后记录产生的菌核数量。

（2）pH对病原菌生长及菌核形成的影响将灭菌后的PDA培养基用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl将pH分别调节到3、4、5、6、7、8、9和10，将直径5 mm的菌饼接种到上述不同pH的PDA平板上，置于30 ℃培养箱中黑暗培养，每处理设3次重复。供试菌株与测试方法同第1.2.1（1）节。

（3）培养基对病原菌生长及菌核形成的影响供试8种培养基分别为PDA、PCA（马铃薯20 g、胡萝卜20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL）、PSA（马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL）、Czapek培养基（MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO4 1 g、KCl 0.5 g、NaNO3 2 g、蔗糖30 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL）、Richards培養基（KNO3 10 g、KH2PO4 5 g、MgSO4·7H2O 2.5 g、蔗糖50 g、FeCl2 0.02 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL）、燕麦培养基（燕麦片30 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL）、玉米粉培养基（玉米粉300 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL）和麦麸培养基（麦麸300 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL）。供试菌株与测试方法同第1.2.1（1）节。

（4）碳氮源对病原菌生长及菌核形成的影响基础培养基选用Czapek培养基，测试不同碳源时，分别用等碳当量的果糖、肌醇、麦芽糖、木糖、葡萄糖、乳糖和山梨醇代替其中的蔗糖，以不加碳源作对照；测试不同氮源时，分别用等氮当量的NH4NO3、NH4Cl、（NH4）2SO4和Ca（NO3）2代替其中的NaNO3，以不加氮源作对照。供试菌株与测试方法同第1.2.1（1）节。

（5）光照对病原菌生长及菌核形成的影响在30 ℃下分别设置连续光照、连续黑暗和12 h光暗交替3个处理，供试菌株与测试方法同第1.2.1（1）节。

（6）菌丝和菌核致死温度的测定将直径为5 mm的菌饼和20粒菌核置于装有少量无菌水的离心管中，在45～55 ℃（梯度为5 ℃）恒温水浴锅中加热10 min，之后用流水使其迅速冷却，在超净工作台上将菌饼和菌核分别转接至PDA平板上，于30 ℃培养箱中恒温培养2 d，每处理重复3次，根据菌丝生长和菌核萌发情况确定菌丝和菌核的致死温度。

1.2.2 室内药剂毒力测定

（1）供试药剂供试药剂名称及浓度如表1所示。

（2）药效测定药剂对菌丝生长影响采用生长速率法测定。将供试药剂用灭菌水按比例进行混合溶解后，加入放置到室温的PDA培养基中进行倒板。每种药剂设5个浓度梯度，以不添加药液的PDA平板为空白对照。在平板中央接种直径5 mm的菌饼，每处理重复3次，置于30 ℃培养箱中黑暗培养，3 d后用十字交叉法测量菌落直径，计算各药剂对菌丝体生长的相对抑制率，以药剂浓度的对数值为自变量x，以菌丝体抑制百分率的几率值为因变量y，计算出毒力回归方程和相关系数R，根据回归方程计算出EC50。

1.3 数据分析

实验数据采用SPSS 20.0和Microsoft Excel 2016软件进行统计分析，应用Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 生物学特性测定

2.1.1 温度对病原菌生长及菌核形成的影响病原菌在15～35 ℃的条件下均能生长，在28～35 ℃能产生成熟菌核，其中30～32 ℃菌落直径最大，培养2 d后达到8.95～9.00 cm；产生菌核数量也最多，培养15 d后产生78～87个，无显著差异，因此可视为最适生长温度；超过35 ℃时菌丝生长量急剧下降，40 ℃以上不能生长，低于25 ℃或高于40 ℃不能产生菌核（图1）。

2.1.2 pH对病原菌生长及菌核形成的影响病原菌在pH为3～9范围内均能生长，在pH为3～7范围内菌落扩展较快，pH为5～6时菌丝生长最快，无显著差异，2 d后菌落直径达到7.77～7.93 cm，说明与碱性相比，弱酸性更有利于温郁金白绢病菌的生长。病原菌在pH为4～9范围内可以产生成熟菌核，pH为7时产生的菌核数量最多，显著高于其他pH的菌核数量（图2）。

2.1.3 培养基对病原菌生长及菌核形成的影响不同培养基对菌丝生长具有显著的影响。在PDA

和燕麦培养基上菌丝生长速度较快，培养2 d菌落直径均大于7.50 cm；其次是PCA、PSA和玉米培养基，培养2 d菌落直径均为7.28 cm，无显著差异；在麦麸、Czapek和Richards培养基上菌丝生长速度最慢。从菌核数量来看，不同培养基间也存在显著差异。其中玉米和燕麦培养基产生菌核较多，15 d分别产生177个和114个；其次是麦麸和PSA培养基，Czapek、PDA和PCA培养基产生菌核数量少，Richards培养基则不能产生菌核（图3）。

2.1.4 碳氮源对病原菌生长及菌核形成的影响不同碳源对菌丝生长和菌核形成有显著的影响。在供试碳源分别作为唯一碳源并配以NaNO3为氮源的营养条件中，蔗糖中的菌丝生长最佳，培养2 d菌丝直径达到6.05 cm；其次是不加碳源的对照、山梨醇、麦芽糖和葡萄糖，在肌醇、果糖、木糖和乳糖中菌丝生长较慢。对于菌核数量而言，培养15 d蔗糖中产生的菌核最多，为25个；其次是山梨醇和不加碳源的对照培养基；其他碳源培养基中均不产生菌核（图4）。

不同氮源对菌丝生长和菌核形成的影响也具有显著差异。在供试氮源分别作为唯一氮源并配以蔗糖为碳源的营养条件中，菌丝生长对氮源的利用以NaNO3最佳，培养2 d菌丝直径达到6.92 cm，其次是（NH4）2SO4、Ca（NO3）2、NH4Cl，不加氮源的对照和NH4NO3最次。培养15 d，NaNO3中产生菌核数量最多，为25个，其次是NH4NO3、Ca（NO3）2和（NH4）2SO4，NH4Cl中产生菌核较少，不加氮源的对照则不产生菌核（图5）。

2.1.5 光照对病原菌生长及菌核形成的影响不同光照条件对菌丝生长和菌核形成具有显著影响。培养2 d后，菌丝在连续黑暗条件下生长最快，直径为8.70 cm；其次是光暗交替条件，直径为8.32 mm；在连续光照条件下生长最慢，直径为7.93 cm。培养15 d后，在光暗交替条件下产生的菌核最多，为316个；其次为连续光照条件，产生223个；在连续黑暗条件中产生菌核最少，为17个（图6）。

2.1.6 菌丝及菌核致死温度的测定如表2所示，供试菌株在50 ℃水浴锅中处理10 min后，菌丝不能正常生长，菌核可以正常萌发；在55 ℃水浴锅中处理10 min后，菌丝和菌核均无法正常生长和萌发。因此，菌丝和菌核的致死温度分别为50、55 ℃。

2.2 室内药剂毒力测定

供试10种药剂对温郁金白绢病病原菌菌丝生长的抑制作用差异较大，共有4种药剂的EC50小于1 mg/L，分别为烯唑醇、吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑和氟硅唑。其中烯唑醇的抑制作用最强，EC50为0.141 2 mg/L；五氯硝基苯、代森锰锌、恶霉灵和中生菌素的抑制作用相对较弱，EC50小于100 mg/L；而代森锌和百菌清的抑制作用最差，EC50均大于100 mg/L，因此不适合用于防治温郁金白绢病（表3）。

3 讨论

白绢病病原菌齐整小核菌S. rolfsii的寄主范围很广，已知危害100多科中的200多种植物[20]。本研究测定了温郁金白绢病菌的生物学特性，结果表明菌丝生长和菌核形成的最适温度为30～32 ℃，与王雅等[13]、唐伟等[21]的研究结果一致。海南属热带季风气候，高温高湿为该病的发生流行提供了有利条件。菌丝和菌核的致死温度分别为50 ℃和55 ℃，这可能是由菌核特殊的致密结构造成的，与李小霞等[17]研究草乌白绢病菌的致死溫度结果一致。温郁金白绢病菌对酸碱度的适应范围较广，在pH 3～9时均能生长；pH 5～6时菌丝生长最好，pH 7时产生菌核最多。这与刘佳等[16]、傅俊范等[12]、战徊旭等[11]的研究结论相似，均表明弱酸性至中性环境更有利于该菌的生长。黑暗条件更有利于菌丝的生长，但不利于菌核的产生，说明菌丝生长和菌核形成对光照的要求不同。

碳源和氮源对微生物的生长发育起着重要的作用，本研究结果显示，温郁金白绢病菌能广泛利用碳氮源，但对不同碳氮源的利用有较大差异。在8种供试碳源中，最大菌落与最小菌落平均直径的差异高达5.27 cm；5种供试氮源中，最大菌落与最小菌落平均直径相差1.27 cm，说明不同碳源对该菌生长的影响明显大于氮源。在8种供试碳源中，只有蔗糖和山梨醇培养基中能产生菌核，其余碳源均不能产生菌核，而在5种供试氮源中都能产生菌核，且不加氮源的对照培养基不能产生菌核，说明菌核的形成对氮源的需求明显大于碳源。

有关白绢病菌毒力测定的研究很多，谢瑾卉等[22]在研究9种杀菌剂对花生白绢病菌的室内毒力测定时，认为三唑类脱甲基抑制剂己唑醇抗菌活性极高，具有广谱性的保护和治疗作用；李丽等[23]在研究鸢尾白绢病综合防治时，认为丙环唑、烯唑醇有较好的抑制作用。本研究在室内条件下测定了10种杀菌剂对温郁金白绢病菌的毒力，结果表明三唑类杀菌剂烯唑醇、苯醚甲环唑和氟硅唑对病菌的抑制效果较好，EC50分别为0.141 2、0.278 5、0.542 2 mg/L，与前人的研究结果相似；除此之外，吡唑醚菌酯和五氯硝基苯在较低浓度对病菌也有着较好的抑制作用，因而在实际防治过程中可以轮换使用，避免单一药剂长时间使用产生的抗药性问题。此次药剂研究结果拓宽了温郁金白绢病田间防治过程中药剂种类的选择范围，但要确定上述药剂是否为防治该病的首选药剂，还需要进一步进行田间防治效果试验，并对施药期及方式等进行研究。

温郁金白绢病的发生流行与栽培管理、气候条件等关系密切，要防治该病害，不能片面使用化学防治方法，需要根据病菌的生物学特性综合考虑各种因素才能达到较好的防治效果。因此，每年应在温湿度较大的季节对温郁金各种植区提前做好白绢病发生动态的监测预报工作，尽量在白绢病潜育期或是发生前期进行药剂防治，以防大面积发生，造成不必要的损失。

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