海南台农芒采后果实炭疽病病原鉴定

陈亭妤 李聪 周国英 李河

摘 要 刺盘孢属（Colletotrichum）真菌是芒果的重要病原菌。本研究采用形态和分子生物学鉴定了海南省台农芒果实采收后炭疽病的病原菌。从台农芒发病果实上总共分离纯化获得38株刺盘孢属真菌。基于形态学特征和多基因序列（核糖体转录间隔区、钙调蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶、谷氨酰胺合成酶、肌动蛋白、微管蛋白），确定引起台农芒采后炭疽病的病原为暹罗炭疽菌（C. siamense）、亚洲炭疽菌（C. asianum）和果生炭疽菌（C. fructicola）。其中果生炭疽菌是我国芒果炭疽病原的首次报道。

关键词 芒果；炭疽病；刺盘孢属真菌；多基因系统发育

中图分类号 S31 文献标识码 A

Abstract Colletotrichum species are the most important and widespread form of decay affecting mango fruit. In this study， Colletotrichum species associated with fruit anthracnose isolated from TaiNong mango in China were subject to molecular and morphological analyses. 38 strains were isolated from TaiNong mango， and identified based on morphologic characteristics and multi-locus （internal transcribed spacer ITS， calmodulin CAL， actin ACT， glutamine synthetase GS， glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GD， β-tubulin TUB） phylogeny analysis. The multi-locus sequence analysis， together with a critical examination of the morphologic characters， revealed three previously described species （C. asianum， C. fructicola and C. siamense）. Only C. siamense and C. asianum have previously been reported from mango， while C. fructicola represent the first report associated with the mango fruits in China.

Keywords mango； anthracnose； Colletotrichum species； multi-locus phylogeny

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.020

台农芒果实营养丰富，甜度极高，核小皮薄肉厚，果肉细致无纤维，主要分布在广西、广东和海南等华南广大地区。炭疽病是芒果的第一大病害，特别是芒果果实采收后抗病性降低，可利用的营养物质增加，炭疽病原菌导致果实在田间或储运中腐烂，有时病果率达60%以上，病果品质下降，每年造成的经济损失高达8 000万元以上，严重威胁着芒果产业的健康发展[1-4]。

刺盘孢屬（Colletotrichum）真菌的大多数相似种无法通过形态学特征来进行区分，目前国内外对炭疽病病原菌的研究主要采用形态学特征结合多基因序列分析鉴定。Weir等[5]在形态学基础上结合多基因系统发育学方法在胶孢炭疽菌复合群（C. gloeosporioides complex）下确定了22个合格种和1个亚种，包括已经发现的合格种13个、描述新种10个。符丹丹[6]报道中国苹果炭疽病的病原有7种，分别是C. aenigma、C. alienum、C. fructicola、C. gloeosporioides、C. nymphaeae、C. siamense和C. orientalis。王玉春等[7]报道的中国主要茶区茶树炭疽菌有3种，分别是C. camelliae、C. fructicola和C. siamense。Lima等[8]采用6个基因位点系列（rDNA-ITS、ACT、GS、CAL、TUB-2和GAPDH），对巴西东北部的芒果炭疽病病原菌进行了研究，发现有5种刺盘孢属真菌能引起芒果炭疽病。我国报道的芒果炭疽病病原菌主要有3种：C. gloesporioides、C. acutatum和C. siamense [9-14]。海南台农芒采后炭疽病原菌尚无相关报道。本研究基于形态学特征，结合多基因分子系统发育分析及致病性测定，鉴定海南台农芒果实采收后炭疽病病原菌种类，为进一步研究该病的发生规律、防治措施等工作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 2017年4—6月，分3次采集了海南省海口市3个水果市场上正在出售的38个发病的台农芒果实。

1.1.2 实验试剂 北京索莱宝科技有限公司真菌基因组DNA提取试剂盒（100T），南京诺唯赞生物科技有限公司Green Taq Mix。

1.2 方法

1.2.1 台农芒炭疽菌分离及纯化 表面消毒后于无菌操作台中用无菌解剖刀切取交界处组织（4～ 5 mm），放入无菌水中冲洗30 s，再放入75%的酒精中30 s，取出后无菌水冲洗2次，每次30 s，置于无菌滤纸上吸干表面水分，倒置于PDA培养基上，封口，放入28 ℃黑暗培养箱中进行培养。待长出菌丝后，从菌落边缘切取三角菌块，转移到新的PDA培养基上，继续28 ℃恒温培养，得到纯菌株。

1.2.2 炭疽菌形态学特征 将菌株接种在PDA培养基上，第7天用灭菌的5 mm打孔器从菌落边缘选取圆片，并转移到PDA培养基上，恒温培养5 d，测量并记录菌落直径、颜色和形态，观察并记录50个分生孢子的大小和形状，记录附着胞形态特征。

1.2.3 炭疽菌分子鉴定

（1）DNA提取、扩增及序列测定 将菌株接种在PDA培养基上培养7 d，刮取适量菌丝放入无菌离心管（1.5 mL）中，采用试剂盒提取DNA。对所有分离筛选获得的菌株，参照Weir等[5]的研究，选择核糖体转录间隔区（rDNA-ITS）、肌动蛋白（ACT）、谷氨酰胺合成酶（GS）、钙调蛋白（CAL）、β-微管蛋白（TUB-2）和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）共6个基因片段进行扩增、测序。引物序列及退火温度如表1所示。

（2）多基因系统发育分析 对测定的序列在GenBank中进行Blast比对，下载和选用Damm等[15]、Weir等[5]和Sharma等[16]炭疽菌模式菌株的序列与本研究分离纯化获得的菌株序列共同构建系统发育树。采用MEGA 6.0构建邻近法（neighbor-joining，NJ）系统发育树，所有碱基赋予相同权重，自举检验（boot-straping）重复1 000次以获得各分支的支持率。

1.2.4 致病性测定及柯赫氏法则验证

（1）孢子液法。对新鲜芒果表面用75%酒精表面消毒处理，取浓度为15×10倍显微镜下每视野30～40个病原菌孢子悬浮液后滴在无伤和有伤（针刺3孔）芒果表面，以无菌水处理作对照（CK），放入培养箱，温度28 ℃，相对湿度98%。

（2）菌丝块法。用5 mm打孔器从菌落边缘取菌丝块，接种于无伤和有伤（针刺3孔）芒果表面，并在菌丝块上覆盖沾有无菌水的脱脂棉保湿，用保鲜膜包裹固定。放入培养箱，温度28 ℃，相对湿度98%。

对上述致病性测定实验中发病的台农芒果实再次分离病原菌，观察菌落、分生孢子形态及分子序列特征，进一步确认是否与原接种炭疽病原菌一致。

1.2.5 其他芒果品种致病性测定 从市场上购买新鲜、健康的其他品种芒果的果实，表面消毒后，分别采用无伤和有伤2种方式接种炭疽病菌，设置空白对照，重复3次，观察实验结果并拍照记录。

2 结果与分析

2.1 系统发育分析

从样品中共分离得到38株刺盘孢属真菌，获得了每个菌株的rDNA-ITS、CAL、GDPH、ACT、GS和TUB6基因序列。所有228条序列提交GenBank保存（GenBank接收號为ITS：MG783043～ MG783080；CAL：MG783157～MG783194；GDPH：MG783233～MG783270；ACT：MG783081～ MG783118；GS：MG783195～MG783232；TUB：MG783119～MG783156）。其中，ITS、CAL、GDPH、ACT、GS、TUB基因序列Blast比对同源性分别为99%、100%、99%、100%、99%和100%。

从系统发育树（图2）中可以看出，38株参与系统学分析的菌株分成了3个进化枝，各进化枝的支持率均较高，分别代表3个分类单元，每个进化支中包含了相应分类单元的模式菌株。其中，M23、M27、M24、M14、M14-1、M25、M5、M6-2、M16、M26、M6、M7和M110共13个菌株与果生炭疽菌（C. fructicola）聚为一支；菌株M15、M9-1、M2-2、M9-2、M2-1共5个菌株与C. siamense聚为一支；菌株M11、M52、M102、M92、M83、M61、M9、M1-1、M12、M17、M17-1、M2、M4-2、M73、M8-1、M4-2、M8、M4-1、M1和M312共20个菌株与C. asianum聚为一支。

2.2 菌株形态学特征

根据形态学特征，38株刺盘孢属真菌也归为C. asianum、C. siamense和C. fructicola三种。

2.2.1 亚洲炭疽菌（C. asianum）共分离获得20株 在PDA培养基上该菌菌落呈灰白色，橙色孢子堆，菌落背面浅黄色，中间深绿色，生长速度10.2 mm/d。分生孢子圆柱状，两端钝圆，部分可见油滴，孢子基部稍宽于顶端，大小（17±1.0） μm×（5.5±0.25） μm。分生孢子可形成黑色附着胞，呈近圆形，褐色，大小为（9.0±1.5） μm×（6.5± 0.5） μm。

2.2.2 暹罗炭疽菌（C. siamense）共分离获得5株 菌株在PDA培养基上呈地毯状，菌落近圆形，气生菌丝由白色和灰白色逐变为深灰色绒状；菌落背面浅灰色至深灰色，中心颜色深，外部颜色浅；可产生橘黄色的分生孢子堆。5 d平均生长速率为11.4 mm/d。分生孢子为单胞，直、圆柱状、无色、光滑、两端钝圆或一端钝圆，另一端稍尖，分生孢子大小为（15±1.6） μm×（4.9±0.55） μm；分生孢子附着胞单个或成簇状分布，浅棕色至深棕色，近球形或短圆柱形，部分轻微不规则形，大小为（9.5±1.9） μm×（5.9±0.85） μm。形态特征与模式菌株一致。

2.2.3 果生炭疽菌（C. fructicola）共分离获得13株 在PDA培养基上，菌落厚重浓密，棉絮状，白色至深灰色，圆形，规则完整，边缘颜色稍浅一些，气生菌丝绒毛状，菌落背面黑色素沉淀，灰白色至深灰色，分生孢子堆浅黄色，5 d平均生长速率10.5 mm/d。营养菌丝透明，光滑，有隔膜，分枝；厚垣孢子未发现；未发现刚毛；分生孢子直，无隔膜，圆柱状或椭圆形，两端钝圆或一端略尖，光滑，无色，单胞，大小为（16.5±0.8） μm× （6.0±0.7） μm。在PDA培养基上培养后期可见有性态。分生孢子附着胞单个或成簇状分布，浅棕色至深棕色，近球形或短圆柱形，大小为（7.5±1） μm× （4.5±0.9） μm。

2.3 柯赫氏法则验证

通过回接致病性实验，所有38个菌株的孢子悬浮液和菌丝块对台农芒无伤和有伤2种处理的均能发病，发病率为100%，发病症状与果实采后自然发病症状一致，对照则未发病。对发病果实进行病原菌分离，分离获得病原菌的培养性状及分生孢子形态、大小均与接种病原菌一致，因此可确定分离获得的38个炭疽菌株均为台农芒炭疽病病原菌。

2.4 芒果品种致病性测定

对不同芒果品种致病性测试结果表明，从采收后台农芒炭疽病斑上分离的3种病原菌C. siamense、C. asianum和C. fructicola在无伤和有伤的情况下均可侵染红玉芒、水仙芒、鹰嘴芒、金煌芒、大青芒等芒果果实，形成黑褐色斑点，这些斑点可在较短时间内连成片。其中，红玉芒极易发病，显症时间最短。

3 讨论

芒果炭疽病病原种类较多。国外报道芒果炭疽病原主要有C. asianum、C. fructicola、C. dianesei、C. karstii、C. tropicale、C. siamense和C. gloeosporioides[5，8，15-16]。目前我国报道的芒果炭疽病病原菌主要有C. gloesporioides、C. acutatum和C. siamense 3种[9-14]。本研究从采收后的海南台农芒炭疽病斑上分离到38株炭疽菌，分成3类，分别是C. siamense、C. asianum和C. fructicola。这3种病原菌在国外均有报道，但国内尚未报道C. fructicola。有意思的是，这38个菌株中没有分离到C. gloeosporioides，这与Phoulivong等[17]的研究发现C. gloeosporioides不是老挝和泰国的芒果炭疽病常见病原的结果一致。另外，本研究未分离到C. acutatum，这与李继勇[13]报道芒果的一种新的炭疽菌C. acutatum不同。

C. fructicola是国内芒果炭疽病原的首次道导。该菌最初的报道是泰国的咖啡果[18]，其模式种被指定为MFLU090228，该菌株现保存为ICMP 18581。C. fructicola目前已知的寄主有沙梨、补血草、苹果、草莓、牛油果、榕属植物、山药、可可属植物[5-7]。本研究总共分离获得13株C. fructicola，形态特征与模式菌株相似，占总分离菌株数的34%。

C. siamense是Prihastuti[18]首次定名的，其模式种为MFLU 09230，该菌株现保存为ICMP 18578。国内报道了长春超市中来自广西和云南的芒果炭疽病原为C. siamense[14]。除了芒果外，该菌还是油茶和茶树等植物的病原菌[19]。有研究者认为C. siamense是一个复合种，而Weir[5]对30株C. siamense进行系统发育分析，发现它们形成一个无法再区分的单系分离枝。Liu[20]也认为C. siamense不存在生殖隔离、地理和寄主植物的基因流障碍，不是复合种。本研究共分离获得5个C. siamense菌株，占总分离菌株的13%。

本研究中，菌株分离率最高的是C. asianum，约占总分离菌株的53%。C. asianum是Prihastuti等[18]从泰国的咖啡树上首次发现和描述的。目前报道的澳大利亚、哥伦比亚，日本、巴拿马、菲律宾和南非等地的芒果上均发现了该病原菌[5-8，15-16]。

经病原菌形态学和分子生物学鉴定，本研究明确了台农芒炭疽病是由C. siamense、C. asianum和C. fructicola三种病原真菌引起，其中C. asianum为优势种类，而C. fructicola为国内芒果炭疽病原的首次报道。3种炭疽病菌对多种芒果品种均具有致病性。研究结果为采收后芒果炭疽病的正确诊断、流行规律、药剂筛选和防治等提供理论依据。

参考文献

[1] 蒲金基， 周文忠. 芒果病虫害的监测化学防治指标和化学防治技术[J]. 中国热带农业， 2012， 49（6）： 45-48.

[2] 张胡焕， 谢艺贤， 蒲金基， 等. 常用杀菌剂及其混剂对芒果炭疽病菌的毒力测定[J]. 农药， 2010， 49（1）： 64-65， 68.

[3] 李 娇， 张燕宁， 张 兰， 等. 芒果炭疽病菌对果实主要品质的影响[J]. 食品科技， 2016， 41（3）： 36-39.

[4] 黄忠兴， 安玉兴， 黄锦福. 海南芒果炭疽病的发生规律与综合防治[J]. 热带农业科技， 2008， 31（2）： 20.

[5] Weir B S， Johnston P R， Damm U. The Colletotrichum gloeosporioides species complex[J]. Studies in Mycology， 2012， 73（1）： 115.

[6] 符丹丹. 中國苹果炭疽病病原菌的遗传多样性[D]. 杨凌： 西北农林科技大学， 2014.

[7] 王玉春， 郝心愿， 黄玉婷， 等. 中国主要茶区茶树炭疽菌系统发育学[J]. 中国农业科学， 2015， 48（24）： 4 925-4 935.

[8] Lima N B， Batista M V A， De Morais Jr M A， et al. Five Colletotrichum species are responsible for mango anthracnose in northeastern Brazil[J]. Fungal Diversity， 2013， 61： 75-88.

[9] 覃丽萍， 史国英， 谢 玲. 芒果炭疽病菌对咪鲜胺的敏感性检测[J]. 南方农业学报， 2013， 44（4）： 594-597.

[10] 汪 远， 詹儒林， 何 红. 红树内生细菌菌株Kc-38的抗菌物质及对采后芒果炭疽病的防效[J]. 中国生物防治学报， 2011， 27（1）： 82-87.

[11] 余 莎， 詹儒林， 何 红. 海洋细菌AiL3防治芒果炭疽病研究[J]. 热带作物学报， 2011， 32（12）： 2 312-2 315.

[12] 张 贺， 彭 军， 喻群芳. 芒果炭疽病菌多重巢式PCR检测体系建立及田间快速检测[J]. 热带作物学报， 2013， 34（5）： 952-957.

[13] 李继勇. 芒果的一种新的炭疽菌的研究初报[J]. 热带作物学报， 1985， 6（1）： 117-121.

[14] Liu L P， Shu J， Zhang L， et al. First report of post-harvest anthracnose on mango （Mangifera indica） caused by Colletotrichum siamense in China[J]. Plant Disease， 2017， 101（6）： 1 038.

[15] Damm U， Cannon P F， Woudenberg J H C， et al. The Colletotrichum boninense species complex[J]. Studies in Mycology， 2012， 73（1）： 1.

[16] Sharma G， Gryzenhout M， Hyde K D， et al. First report of Colletotrichum asianum causing mango anthracnose in South Africa[J]. Plant Disease， 2015， 99（5）： 725.

[17] Phoulivong S， Cai L， Chen H， et al. Colletotrichum gloeosporioides is not a common pathogen on tropical fruits[J]. Fungal Divers， 2010， 44（1）： 33-43.

[18] Prihastuti H， Cai L， Chen H， et al. Characterization of Colletotrichum species associated with coffee berries in northern Thailand[J]. Fungal Divers， 2009， 39（2）： 89-109.

[19] 李 河， 李 楊， 蒋仕强， 等. 湖南省油茶炭疽病病原鉴定[J]. 林业科学， 2017， 53（8）： 43-53.

[20] Liu F， Wang M， Damm U， et al. Species boundaries in plant pathogenic fungi： a Colletotrichum case study[J]. BMC Evolutionary Biology， 2016， 16（81）： 1-14.