生长素抑制油菜素内酯导致的水稻根不对称生长

杨文 蔡泽坪 于旭东 罗佳佳 吴繁花 孟帅良

摘 要 外源施加10–2 mg/L 2，4表油菜素内酯（2，4-Epibrassinolide，2，4-eBL）能导致水稻（Oryza sativa L.）初生根发生不对称生长形成波浪形弯曲和卷曲。施加高浓度生长素能够抑制此现象，同时DR5-GUS结果表明在发生不对称生长的根中，根内圈生长素分布较高。本文阐述了外源施加生长素抑制2，4-eBL导致的水稻根不对称生长现象，为探究油菜素内酯与生长素之间的相互关系提供理论依据。

关键词 油菜素内酯；生长素；水稻；根；不对称生长

中图分类号 S59 文献标识码 A

Abstract Exogenous application of 102 mg/L 2， 4-epibrassinolide（2，4-eBL） resulted in asymmetric growth of Oryza sativa L. primary root， forming wave and coiling. High concentration of auxin could inhibit this phenomenon， DR5-GUS showed that auxin was higher in the inner ring of asymmetric growth roots. 2， 4-epibrassinolide induced asymmetric growth of the root of O. sativa L.， and this could be inhibited by auxin， which a providing theoretical basis for the study of the relationship between brassinolide and auxin.

Keywords brassinolide； auxin； Oryza sativa L.； root； asymmetric growth

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.007

油菜素類固醇（brassinosteroids， BRs）在植物界中普遍存在，其结构同动物固醇类激素相似，在低于毫摩尔的浓度下发挥生理作用，被认为是第六大植物激素[1-3]。自从1979年Grove等[4]从油菜（Brassica campestris L.）的花粉中分离出油菜素内酯（brassinolide， BL）以来，已经鉴定出了约70种多羟基甾醇衍生物。BR能参与多种植物的发育和生理过程，如细胞伸长、细胞分裂、木质部发育、应激和抗病性等[5]。在这些具有生物活性的BRs中，BL的活性最高[6-7]。外源施加纳摩尔至微摩尔的BL能够影响植物细胞的伸长、分裂、分化以及组织器官的弯曲生长[7-8]。但BR在植物体各器官中的分布存在显著差异，尤其在根中的含量甚微，从而导致其在根中的发现晚于下胚轴及植物体的其他部位。与此对应的是，根对BR的反应要比植物体的其他部位敏感得多[9]。目前的研究已证明，BR能够在根中合成并发挥重要作用，BR能够影响根长、侧根数目、不定根形成以及根对重力的感受等[8， 10]。

同时BR与生长素之间存在着紧密联系。生长素可以通过调节BR生物合成酶DWARF4（DWF4）和CPD的基因表达来调控内源BR的含量[11-12]。同时转录组分析表明BR途径能激活大量与生长素相关的基因表达[13]。在调控根生长的过程中，生长素和BR共同控制细胞分裂、伸长、维管束分化和衰老、根的向地性等[8]。在玉米（Zea mays L.）根部，BR通过增加根对生长素的敏感性来增加向地性，且使用生长素运输抑制剂2，3，5-三碘苯甲酸（TIBA）可以消除这种响应[14]。BR也参与调控拟南芥（Arabidopsis）根的向地性生长，外源施加BR刺激ROP2的活性，从而改变内源生长素的分布，导致根向地性增强[15-16]。同时，BR与生长素相互拮抗，通过维持干细胞稳态、调控细胞分裂和分化，共同维护根的正常生长[17-18]。本研究以外援施加高浓度生长素打破内源生长素不对称分布作为切入点，阐述了外源施加2，4表油菜素内酯（2，4-epibras?sinolide，2，4-eBL）导致水稻根不对称生长的现象及在此过程中与生长素之间的关系，为BR与生长素的研究提供新的见解。

1 材料与方法

1.1 材料

水稻种子为“准两优2号”由国家杂交水稻研究中心清华深圳龙岗研究所用准SxR402 杂交选配选育而成。2，4-eBL（code E-1641）购自Sigma公司，用75%乙醇溶解并配置成0.04 mg/mL母液，吲哚-3-乙酸（IAA）和2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）用50%乙醇溶解并配置成1 mg/mL母液，均于4 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 水稻种子灭菌及催芽 挑选颖果不开裂且饱满的种粒500颗为一组置于小培养皿中，用75%乙醇灭菌1 min后用自来水冲洗8～12遍，置于一次性小培养皿中并加入少量自来水，在培养间条件下催芽2 d。挑选萌发一致的水稻用于实验。

1.2.2 外源施加2，4-eBL导致水稻初生根不对称生长 用自来水配制终浓度分别为0、10–1、10–2、10–3、10–4、10–5、10–6、10–7 mg/L的2，4-eBL水溶液，作为水稻培养液。1 d后统计水稻幼苗初生根的根长及不对称生长情况。

1.2.3 外源施加生长素不能导致水稻初生根不对称生长 自来水配置终浓度分别为0、10–5、10–4、10–3、10–2、10–1、1、10 mg/L的IAA水溶液和终浓度分别为0、10–6、10–5、10–4、10–3、10–2、10–1、1 mg/L的2，4-D水溶液，作为水稻培养液。1 d后统计水稻幼苗初生根的根长及不对称生长情况。

1.2.4 外源施加高浓度生长素抑制2，4-eBL导致的水稻初生根不对称生长 自来水配置终浓度分别为0、10–5、10–4、10–3、10–2、10–1、1、10 mg/L的IAA水溶液和终浓度分别为0、10–6、10–5、10–4、10–3、10–2、10–1、1 mg/L的2，4-D水溶液，在以上IAA或2，4-D浓度梯度水溶液中各加入2，4-eBL使其終浓度为10–2 mg/L，作为水稻培养液。2 d后统计水稻幼苗初生根的根长及不对称生长情况。

1.2.5 GUS染色 取发生coiling的新鲜水稻根置于1.5 mL的离心管中，加入GUS染液（成分：100 mmol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.0）；10 mmol/L EDTA；0.1%（V/V）Triton X-100；0.5 mmol/L亚铁氰化钾；0.5 mmol/L铁氰化钾；20%（V/V）甲醇，1 mmol/L X-Glu），在37 ℃下温浴12～36 h后用70%酒精脱色3次，显微镜观察拍照。

1.3 培养条件

温度（24±2）℃，光强1 000 lx，光周期为光照16 h/d，黑暗8 h/d。每个培养皿（? 150 mm）中均倒入30 mL培养液，调节pH=7.0，整齐接入30颗水稻种子（催芽2 d）/幼苗，设立5组重复。

1.4 数据分析

水稻幼苗初生根的不对称生长比例=根发生不对称生长的水稻幼苗数/水稻幼苗总数。采用u检验进行实验组与对照组的显著性分析。

2 结果与分析

2.1 外源施加2，4-eBL导致水稻初生根不对称生长

在实验结果中，水稻幼苗根的不对称生长有2种模式。① 波浪形弯曲（wave）：波峰、波谷交替出现，连续3次以上（波峰-波谷-波峰或波谷-波峰-波谷）（图1-f）。② 卷曲（coiling）：根绕中心轴连续旋转一圈以上（图1-g）。wave与coiling可同时出现于同一根中，有wave-coiling、coiling-wave、wave-coiling-wave等各种形式，但以wave-coiling类型（图1-h）为主。

在无2，4-eBL作用的情况下，水稻幼苗初生根自然向下生长，发生coiling、wave、wave+coiling的比例仅有0.5%、1%、0.6%（图1-a、k）。将催芽2 d的水稻幼苗置于不同浓度2，4-eBL的培养液中，温室条件下培养1 d，根的形态随着2，4-eBL浓度的变化而变化。在浓度为10–7～10–3 mg/L时，根发生coiling、wave、wave+coiling的比例与对照无显著差异，均低于7.0%。在2，4-eBL浓度为10–2 ～10–1 mg/L情况下根不对称生长的比例迅速增加，均与对照有极显著差异。其中浓度等于10–2 mg/L时，coiling、wave、wave+coiling的比例分别为46.8%、16.3%、17.8%。浓度为10–1 mg/L时，比例为35.3%、18.4%、31.7%（图1-b、k）。对照组根长为1.41 cm，当2，4-eBL浓度为10–7 mg/L时根增长为1.67 cm，与对照有显著差异。当浓度为10–6～10–1 mg/L时根长与对照无显著差异（图1-k）。

2.2 外源施加生长素不能导致水稻初生根不对称生长

在无IAA作用的情况下，水稻幼苗发生coiling、wave、wave+coiling比例均小于6.0%。将催芽2 d的水稻幼苗置于不同浓度IAA的培养液中，温室条件下培养1 d，根的形态在10–5～1 mg/L IAA浓度梯度下，coiling、wave、wave+coiling比例变化不大，均与对照无显著差异。当IAA浓度为10 mg/L时coiling、wave、wave+coiling的比例均为0，其中wave与对照出现极显著差异（图1-c、l）。对照组根长为1.30 cm，当IAA浓度在10–5～10–1 mg/L时根长均与对照无显著差异。当IAA浓度为1～10 mg/L时根长受到抑制，长度分别为0.66、0.42 cm，均与对照有极显著差异（图1-i、l）。

在无2，4-D作用的情况下，coiling、wave、wave+coiling比例均小于3.5%。2，4-D浓度为10–6～10–1 mg/L时，coiling、wave、wave+coiling比例变化不大，均与对照无显著差异，除10–1 mg/L时wave比例上升到13%。当2，4-D 浓度为1 mg/L时coiling、wave、wave+coiling比例下降为0，其中wave与对照出现显著差异（图1-d、m）。对照组根长为1.52 cm，当2，4-D浓度为10–6～10–4 mg/L时根长均与对照无显著差异。当2，4-D浓度大于10–4 mg/L时，随着浓度增加根长逐渐缩短，10–3～10–2 mg/L时根长为1.35 cm、1.37 cm，均与对照有显著性差异，10–1～1 mg/L时根长为1.04、0.63 cm，均与对照有极显著差异（图1-j、m）。

高浓度IAA和2，4-D均能抑制水稻初生根的生长，但在各个浓度处理中，根的不对称生长率较低且没有显著的变化。

2.3 外源施加高浓度生长素抑制2，4-eBL导致的水稻初生根不对称生长

在10–2 mg/L 2，4-eBL作用下，大部分根在2 d后被诱导发生了不对称生长，coiling、wave、wave+coiling比例为86.2%、4.6%、4.1%（图2-a、f）。当添加不同浓度的IAA时，在0～1 mg/L IAA下根的不对称生长没有明显变化，coiling、wave、wave+coiling的比例均与对照组无显著差异。但在10 mg/L的IAA作用下根的不对称生长现象基本消失，coiling、wave、wave+coiling比例为7.3%、6.0%、0，其中coiling、wave+coiling与对照组均有极显著差异（图2-b、f）。对照组根长为1.45 cm，当IAA浓度为10–5～10–2 mg/L时根逐渐伸长，IAA浓度在10–5～10–4 mg/L时与对照有显著差异，10–3～10–2 mg/L时与对照有极显著差异。当IAA浓度为10 mg/L时根长受到抑制，与对照有极显著差异（图2-f）。

在10–2 mg/L 2，4-eBL作用的情况下，大部分根在2 d后被诱导发生了不对称生长，coiling、wave、wave+coiling比例为89.8%、1.1%、7.3%。当添加不同浓度24-D时，在0～10–1 mg/L 24-D下coiling、wave、wave+coiling比例变化不大，与对照组无显著差异。24-D浓度为1 mg/L时coiling、wave、wave+coiling比例均为0，其中coiling、wave+coiling与对照组均有极显著差异（图2-c、g），对照组根长为1.42 cm，在10–5～10–4 mg/L 24-D浓度下根长逐渐增长，均与对照有极显著差异。在10–1～1 mg/L浓度下根长缩短，均与对照有极显著差异（图2-g）。

当培养液中添加10 mg/L的IAA，由2，4-eBL造成的根不对称生长现象完全消除，但随着培养天数的延长，根的不对称生长逐渐恢复。在0、1 d时，coiling、wave、wave+coiling比例均为0。2 d时，coiling、wave、wave+coiling比例为3.2%、8.4%、1.1%，此时wave已与0 d有极显著差异。4 d时，coiling、wave、wave+coiling比例为57.9%、12.7%、23.1%，均与0 d有极显著差异。同时随着培养时间的延长，根长也逐渐变长，对照组根长为0.13 cm，1、2、3、4 d后根长分别为0.43、0.73、2.28、3.28 cm，均与对照有极显著差异。可见IAA对2，4-eBL造成的根不对称生长的拮抗效应并不具有持续性（图2-d、h）。对培养液中的IAA浓度进行测定，结果显示IAA浓度随着培养天数的增加而迅速降低，0 d时IAA浓度为10.5 mg/L，2 d时IAA浓度为2.15 mg/L，与0 d有极显著差异，4 d时IAA仅剩0.4 mg/L（图2-i）。而在添加2，4-D实验的0～4 d内，coiling、wave、wave+coiling比例均为0，根长由0.3 cm缓慢生长到1 cm。表明2，4-D能够持久地起到拮抗作用（图2-e、j）。

2.4 DR5-GUS染色结果

DR5是生长素响应的启动子，经过GUS染色可以直接观察到生长素在根中的分布。染色结果显示，发生coiling的根中生长素的分布是不对称的，根尖处内圈染色较外圈深，表明内圈生长素含量高（图2-k）。

3 讨论

本研究证明，高浓度2，4-eBL能诱导水稻初生根不对称生长，形成wave和coiling，而调控植物生长的激素中唯独生长素具有极性运输功能[19]。生长素的极性运输可以造成生长素的不对称分布，從而造成根的不对称生长[20]。由此看出生长素的极性运输与不对称分布极有可能是造成根卷曲的直接内在因素。通过实验发现：

（1）高浓度2，4-eBL能诱导水稻根不对称生长。实验中发现，在高浓度2，4-eBL作用下，根的不对称生长多为wave和coiling，与对照中根的随机弯曲是不同的。wave和coiling是根有规律的不对称生长，对照弯曲是根在触碰瓶底后随机发生的，两者在形态上存在很大差异，易于区分。

（2）添加10–5～10 mg/L IAA或10–6～1 mg/L 2，4-D的情况下，根的不对称生长率较低且没有显著的变化，说明外源施加生长素并不能诱导根不对称生长。外源施加的生长素能通过根的吸收直接影响内源生长素水平[21]。因此内源生长素水平的高低不是造成根不对称生长的原因。

（3）在IAA+10–2 mg/L 2，4-eBL或2，4-D+ 10–2 mg/L 2，4-eBL情况下，低浓度IAA或2，4-D不足以降低coiling及wave的比例，但当施加10 mg/L的IAA或1 mg/L的2，4-D时明显地抑制了coiling及wave的形成。导致2，4-D比IAA更显著地破坏根不对称生长的原因有3种，包括感知差异、运输差异和代谢差异。产生感知差异的原因是目前的2种生长素受体系统ABP1和TIR1对2，4-D的亲和性大于IAA[21]。产生运输差异的原因是IAA具有输出载体（PIN蛋白）输出细胞，而2，4-D没有输出载体，只能通过被动扩散出细胞，于是在细胞中积累，导致其在细胞中浓度大于IAA[9， 22]。产生代谢差异是由于IAA是一种天然的植物激素，植物已经发展出许多机制来调节其稳态，而2，4-D是合成分子，因此不被植物代谢调节[21]。高浓度生长素对根不对称生长的抑制作用是由于外援施加高浓度生长素具有使根中生长素趋于平均化的作用，趋向于高位，从而抑制了wave和coiling的形成。

（4）高浓度IAA对根不对称生长的消除作用并不是长期的，2 d后消除作用减弱，coiling及wave会重新形成，这是培养液中的IAA被植株体内的吲哆乙酸氧化酶氧化成没有活性的吲哚醛的结果[23]。通过对培养液中IAA浓度的测定发现，吲哆乙酸氧化酶具有极强的氧化作用，3 d后就能将培养液中95%以上的IAA氧化完全。与IAA作用不同的是，2，4-D对根不对称生长的抑制作用是长期的，这是由于植物体中没有相应的能够氧化2，4-D的氧化酶[21]。

（5）通过DR5-GUS染色结果显示根尖处内圈染色较深，表明生长素在内圈分布较高，可能是造成根不对称生长的原因[24]。以上实验证明了BL能诱导水稻根不对称生长，同时根内生长素发生了不对称分布。

有研究发现，BR和生长素信号显著重叠。Nemhauser等研究表明，BR和生长素在控制拟南芥下胚轴伸长方面有很强的相互依赖性。为了扩展这个分析，Nemhauser使用22K的Affymetrix芯片来识别BR与模拟处理幼苗之间差异表达的基因，发现由BR和生长素分别上调的342个和336个基因中，1/4在相似（早期）时期内受到2种激素的调节。这些观察结果表明，虽然BR和生长素独立地调节大量基因，但重要的子集是由2种激素共同调控的[25-26]。同时也有证据表明BR和生长素是可以独立运作的，当用BR处理拟南芥野生型（WT）或BR缺陷型突变体det2的幼苗时，内源IAA水平不增加。目前许多研究发现了BR和生长素之间的相互作用，但是具体机理还知之甚少[27-28]。本文探究了2，4-eBL导致水稻初生根不对称生长的现象及在此过程中高浓度生长素的抑制作用，为进一步了解BR与生长素之间的关系提供理论依据。

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