头花蓼种子生活力TTC法最优测定条件研究

王志威 魏升华 李俊 严福林 魏怡冰 杜富强 邓娇

摘 要 试验研究用四唑染色法（TTC法）测定头花蓼（Polygonum capitatum）种子活力的最优条件。以染色温度、染色时间和TTC染色浓度为指标，通过单因素试验、正交试验、响应面试验对头花蓼种子活力测定的最优条件进行研究。结果：染色温度40 ℃、染色时间180 min和TTC浓度20 mmol·L-1为头花蓼种子活力测定的最优条件；三个检测指标对种子活力测定影响的大小顺序为染色温度>染色时间>TTC染色浓度。认为TTC法是一种测量头花蓼种子活力的有效方法，能够快速客观评价头花蓼种子的发芽能力，为预测其播种量和出苗率提供科学依据和技术支持。

关键词 头花蓼；种子生活力；TTC染色法；最优测定条件

中图分类号：S339.3+1 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.25.001

头花蓼（Polygonum capitatum），又称石莽草、石辣蓼、四季红[1-2]，是蓼科蓼属的多年生匍匐草本植物，入药为其地上部分或干燥全草[3-4]。其味苦、辛，性凉；归肾、膀胱经；功效清热利湿，解毒止痛，活血散瘀，利尿通淋；主治痢疾、膀胱炎、尿路结石、肾盂肾炎等[5-6]。头花蓼是我国西南地区民间常用传统中草药，也是该地区一种极为重要的苗药[7-9]，在治疗泌尿系统疾病等疾患上具有独特的疗效，目前是贵州威门药业股份有限公司产品“热淋清颗粒”的原药材，同时也是“热清淋胶囊”“四季草颗粒”和“泌淋胶囊”等的原材料[10-15]。头花蓼除了药用之外，因其植株覆盖力较强，成片生长时观赏性很好，故也是一种具有较大开发前景的观赏性地被植物[16-18]。

近年来，有关头花蓼的研究报道很多，但主要集中在其化学成分与药理作用研究上。如张丽娟等（2012）对头花蓼的黄酮类成分进行了研究，结果表明，头花蓼中的黄酮类成分可能与其抗菌、抗炎活性相关，是头花蓼的药效物质基础[19]；程欣霞等（2010） 采用高速逆流色谱技术对头花蓼水提粉末的正丁醇粗提取物进行了分离纯化，首次报道在头花蓼中分离得到短叶苏木酚酸[20]。

随着头花蓼中有效化学成分的大量发现及相关产品的大量开发，头花蓼的市场需求也逐年增加，目前已逐渐从依赖野生资源采集转为规范化和规模化种植[21]。由于种子种苗的质量是药材产量和品质形成的重要基础和前提[22]，因此头花蓼种子的质量在种植过程中起着至关重要的作用。尽管发芽率是检测种子质量的重要指标，但实践证明头花蓼的发芽时间较长，此法不能很好地满足实际生产需要。四唑染色法（TTC染色法），是一种可快速测定种子活力的化学方法，是种子生产和贸易中的重要技术[23-25]。本研究使用TTC染色法，通过单因素试验、正交试验和响应面试验，对头花蓼种子活力测定的最优条件进行探讨，以期为快速客观评价头花蓼种子的发芽能力、预测其播种量和出苗率提供科学依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

头花蓼种子样品于2016年9月采自贵州威门药业股份有限公司头花蓼资源圃，置于贵阳中医学院种子库4 ℃常温库保存备用。

1.2 试剂

2，3，5-氯代三苯基四氮唑，磷酸二氢钠，氢氧化钠，去离子水。

1.3 种子预处理方法

1.3.1 浸泡

挑选净种子，将其放在奥林巴斯连续变倍体视显微镜下，用镊子与解剖刀将种子的两端切去一部分，使其胚两端露出，之后将其放于置有滤纸的培养皿中，加去离子水浸泡种子，加水量以刚好没过种子为宜，浸泡30 min使其吸胀后取出，将种子挑至另一置有滤纸的培养皿中。每个培养皿中放50粒种子，供染色用。

1.3.2 染色

在每个培养皿加入不同濃度的TTC溶液，溶液量以没过种子为度，分别置于不同温度的恒温培养箱中避光染色，达到预设时间后取出，用去离子水冲洗后将种子放于滤纸上，根据种子染色面积的大小和程度判断种子的活力。此外，另取50粒种子置于沸水中煮15 min后取出，并依据相同条件进行染色，作为对照组。每个处理重复3次。

1.4 种子活力最优测定条件试验

1.4.1 单因素试验

染色温度：取头花蓼种子50粒，TTC浓度为10 mmol·L-1，染色时间为60 min，分别置于25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃温度下染色，测定种子活力。

染色时间：取头花蓼种子50粒，TTC浓度为10 mmol·L-1，染色温度为30 ℃，染色时间分别为30 min、60 min、120 min、180 min、210 min，测定种子活力。

TTC浓度：取头花蓼种子50粒，染色温度为30 ℃，染色时间为60 min，分别置于浓度为5， 10， 15， 20， 25 mmol·L-1的TTC溶液中进行染色，测定种子活力。

1.4.2 正交试验

根据单因素试验结果，选择染色温度（A）、染色时间（B）和染色浓度（C）三个因素，每个因素三个水平，每组50粒头花蓼净种子，因素水平设定见表1。

1.4.3 响应面优化试验

根据单因素试验的结果，以染色温度（A）、染色时间（B）、染色浓度（C）三因素为变量，以种子染色率（R）为响应值，根据Central-Composite中心组合试验设计原理，设计三因素五水平的响应面试验（见表2），每组50粒头花蓼净种子。

1.5 数据分析

采用SPSS 16.0和Design Expert 8.0.6软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

由表3可知，头花蓼种子的着色率随着温度的升高而升高，但从40 ℃以后着色率的增加趋于平缓，因此最适染色温度在40 ℃左右；由表4可知，头花蓼种子的着色率随染色时间的增加而升高，当染色时间达到180 min时，种子着色率最高，当染色时间再增加时，种子着色率反而降低，因此最佳染色时间在180 min左右；由表5可知，头花蓼种子着色率随着浓度的升高而升高，但从染色浓度20 mmol·L-1之后着色率的增加趋于平缓，因此最适染色浓度在20 mmol·L-1左右。

2.2 正交试验结果

由表6可知，头花蓼种子活力最高（82%）的处理组合为：染色温度40 ℃，染色时间180 min，TTC浓度20 mmol·L-1；种子活力最低（8%）的组合为：染色温度30 ℃，染色时间60 min，TTC浓度10 mmol·L-1。方差分析结果（表7）显示，染色温度、染色时间和TTC浓度差异均不显著，从三因素的P值及F值的大小可知，三因素对头花蓼种子活力测定影响力大小顺序为染色温度>染色时间>TTC浓度。

2.3 响应面优化

2.3.1 模型的建立

用Design Expert 8.0.6软件中的Central Composite Design对头花蓼种子活力测定响应面试验结果（见表8）进行多元回归分析，得回归方程为：

R=55.71+22.79a+18.03b+7.07c-4.00ab-5.50ac+10.00bc-3.42a2-8.01b2-2.35c2 （1）

方程（1）方差分析结果（见表9）：F=39.79，且P<0.000 1，表明模型具有极显著性差异，在整个被研究的回归区域内拟合较好。模型的决定系数为0.972 8，说明模型可以解释响应值90.5%种子活力的变化，调整决定系数为0.948 4，与决定系数相差很小，表明模型拟合度高。模型的变异系数为13.71%（<15%），表明试验具有可信度和精确度；试验的信噪比为21.334（>4），较为合理，适用于头花蓼种子活力测定优化试验。模型系数的显著性检验表明，a、b、c、bc、b2各项具有极显著性，ac项具有显著性，且三因素对头花蓼种子活力测定的影响顺序为染色温度>染色时间>染色浓度，进一步支持了正交试验的结论。

2.3.2 响应面分析及最佳优化条件的确定

响应面分析能直观体现两个因素交互作用对种子活力的影响，响应面的坡度越陡，则两个因素的交互作用对种子活力响应值的影响越显著。由图1可知，染色温度和染色时间交互作用时响应面的坡度最陡，其次是染色温度和染色浓度，最后是染色时间和染色浓度，这进一步支持了正交试验中的“三因素对头花蓼种子活力测定值影响顺序为染色温度>染色时间>染色浓度”的结论。用Design Expert 8.0.6软件中的Central Composite Design分析，得出头花蓼种子最优测定条件为：染色温度40 ℃，染色时间180 min，染色浓度20 mmol·L-1，此预测的条件与正交试验的结果一致。

3 结论和讨论

采用TTC染色法对常用苗药头花蓼的种子进行了活力最优测定条件研究，总结和讨论于下。

1）染色温度、染色时间和TTC染色浓度均为活力测定的关键因素，三者中的某一者或二者互作均会对头花蓼种子活力测定产生影响。类似的情况同样存在于其他药用植物种子活力TTC法测定的研究结果中，如：张瑜等（2013）对猪屎豆种子进行TTC染色的研究发现，TTC浓度、染色温度和染色时间影响猪屎豆种子的染色效果[26]；成小璐等（2016）对羊耳菊的种子活力测定发现，TTC浓度、染色温度和染色时间为羊耳菊种子活性的三条重要检测指标[24]。

2）三因素对头花蓼种子活力测定影响的大小顺序为染色温度>染色时间>TTC浓度。从实际生产需要出发，由于TTC和温度都存在价格成本，因此可依据本文中的结论，适当降低染色温度或TTC浓度，而通过延长染色时间从而达到节约成本的目的。

3）本研究同时运用正交法和相应面法结果进行数据分析，结论均表明，头花蓼种子活力TTC测定的最优条件为：染色温度40 ℃，染色时间180 min，TTC浓度20 mmol·L-1。响应面法能考察各因素间的相互作用，精密度较高，在研究上和正交试验一起使用，可弥补正交试验的不足。如：在优化丹参提取工艺时，李绍林等[27]用正交法，以提取次数、提取时间、醇浓度和溶媒量作为考察因素，发现只有提取次数对结果具有显著性影响；而黄元红等[28]用响应面法得到4个因素影响均较显著，并结合回归方程和响应面结果最终确定其最佳工艺条件。成小璐等（2016）[24]对羊耳菊种子活性的TTC法检测研究发现，和正交试验法相比较，响应面分析法在试验设计和结果表达方面更加优良，能进一步确定并弥补正交试验的结果。因此，笔者认为，在种子活力TTC法检测的过程中，为了保证数据结果的科学性，可同时考虑运用正交法和响应面法。

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（责任编辑：丁志祥）