贵阳市河水中大肠杆菌O157：H7的检测

袁光宇 龚维瑶 贾玲玲

摘要[目的]检测贵阳市河水中大肠杆菌O157：H7。[方法]通过大肠杆菌O157：H7毒力基因志贺样毒素2（stx2）、α-溶血素（hlyA）、紧密黏附素（eaeA）设计3对引物，并建立了实时荧光定量PCR检测方法对8株菌株进行特异性、灵敏度检测，利用该方法检测了采集自贵阳市部分河流10组水样。[结果]该方法能够特异扩增大肠杆菌O157：H7毒力基因，灵敏度为127 ng/mL;检测水样结果与国标方法相比，其灵敏度为87.5%，特异度为97.1%，准确度为94.0%。[结论]该方法的建立能够为大肠杆菌O157：H7检测提供较好的理论基础。

关键词实时PCR;大肠杆菌O157：H7;毒力基因

中图分类号R123.1文献标识码

A文章编号0517-6611（2018）28-0167-02

Detection of Escherichia coli O157：H7 from River Water of Guiyang City

YUAN Guangyu，GONG Weiyao，JIA Lingling et al（Guizhou Kwinbon Science and Technology for Food Safety Co.，Ltd.，Guiyang，Guizhou 550009）

Abstract[Objective] The research aimed to detect the Escherichia coli O157：H7 from river water of Guiyang City[Method]3 pairs of primers were designed by using E.coli O157：H7 virulence gene Shiga toxin 2 （Stx2），alpha hemolysin （hlyA） and tight adhesin （eaeA）.Quantitative realtime PCR assay was established to detect the specificity and sensitivity of the 8 strains.10 water samples collected from some rivers in Guiyang City were detected by this method.[Result]The method could amplify the virulence gene of E.coli O157：H7 and the sensitivity was 127 ng/mL.Compared with the national standard method，the sensitivity of the detected water sample was 87.5%，the specificity was 97.1%，and the accuracy was 94.0%.[Conclusion]The establishment of the method can provide a good theoretical basis for the detection of E.coli O157：H7.

Key wordsRealtime PCR;Escherichia coli O157：H7;Virulence gene

肠出血性大肠杆菌是大肠杆菌成员中的一个亚型，主要分为26、111、157这3类血清型，感染后能导致人类出现出血性肠炎、溶血性综合症而得名，3类血清型中主要能引起人类感染性腹泻的菌株是O157：H7[1-2]。大肠杆菌是污染食品导致食品安全事件的微生物重要组成之一，病原菌的污染可能在食品的生产与加工、食品包装、运输、保存及消费等各环节。大肠杆菌的检测方法主要有常规的培养鉴别检测方法、胶体金试纸条、免疫磁珠分离检测、PCR检测等[3-5]。

在食品生产交易链中，常规的细菌培养、鉴定方法需要多个步骤检测，检验周期较长，不能满足食品安全快速检测要求。实时荧光定量PCR（Real-time PCR）是能特异性扩增DNA片段的分子生物学方法，在生物體外实现DNA的复制，以荧光信号强度测DNA的总量[6-7]。笔者建立于大肠杆菌O157：H7毒力基因志贺样毒素2（stx2）、α-溶血素（hlyA）、紧密黏附素（eaeA）基因设计引物片段[6-7]，Real-time PCR扩增细菌基因组依据荧光信号实现快速检测。

1材料与方法

1.1试材试验涉及菌株信息见表1。DNA Maeker、DNA提取试剂盒DP302购买于天根生化科技有限公司;2×SYBR Green PCR Mastermix购买于Solarbio;其他化学试剂购买于国药。

1.2仪器凝胶成像仪BIO-RAD、电泳仪购买于Thermo公司;实时荧光定量PCR扩增仪购买于Thermo;高速离心机5424D型购买于Eppendorf公司。

1.3方法

1.3.1引物设计。

搜索GenBank公布的大肠杆菌O157：H7菌株志贺样毒素2（AF162758.1）、α-溶血素（U12572.1）、紧密黏附素（U32312.1）基因序列，利用Primer-BLAST 设计引物。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物信息如下所示：

hlyA-For：5′-TCTGACAGGAGGAAGCGGTA-3′

hlyA-Rev：5′-CTCCTGAGGCATCTTTCGCA-3′

stx2-For：5′-AACTGCATATTGCCCCGTCA-3′

stx2-Rev：5′-TGTGATGGATGGTGCCAGAC-3′

eaeA-For：5′-AGCGTTACGTTTCCCTCTCG-3′

eaeA-Rev：5′-CCGGGTCCGGGTATAACAAC-3′

1.3.2DNA的提取及反应体系建立。表1各细菌接种在10 mL 适宜液体培养基，摇床培养过夜，按DNA提取试剂盒方法提取细菌基因组DNA。

Real-time PCR反应体系：DNA模板1 μL，2×Mastermix 10 μL，Primer for/rev 2 μL，ddH2O 7 μL。反應条件为95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环后72 ℃持续5 min。

1.3.3特异性及灵敏度测试。

利用建立的Real-time PCR反应体系，以3对特异性引物分别检测表1中所示菌株基因组DNA。大肠杆菌O157：H7基因组DNA按10倍梯度稀释至10-6，取1 μL作为模板，用于验证方法的灵敏度。

1.3.4样本检测。

采集自贵阳市部分河流水样50份，分别进行增菌后，按建立的Real-time PCR试验方法和微生物学检验标准[8]进行检测。

2结果与分析

2.1方法特异性

经荧光等温扩增仪扩增表1中8株细菌基因组DNA，荧光信号强度结果如图1所示，将同一菌株PCR产物混合后琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示。图1显示，大肠杆菌O157：H7所扩增基因stx2、hlyA、eaeA荧光信号呈指数增加，其余7株均未检测到荧光信号的变化。图2显示，8株细菌扩增基因仅大肠杆菌O157：H7出现3条DNA条带，分别为522、386、279 bp。

2.2灵敏度测试

大肠杆菌O157：H7基因组DNA经核酸浓度测定仪检测浓度为127 ng/μL，按10倍梯度稀释至10-6，取1 μL作为模板，将引物混合按建立的检测方法验证其灵敏度，检测结果如图3所示。由图3可知，当DNA浓度为127 ng/mL时40 min后荧光信号呈指数增加。因此，该研究建立的方法其灵敏度为127 ng/mL。

2.3水样检测采集自贵阳市10处河流每处5份水样，共计10组50份。分别采用Real-time PCR方法和国标方法GB 4789.36—2016

检测大肠杆菌O157：H7，Real-time PCR方法和国标方法检测比较结果如表2。结果显示（表2），测出阳性样品分别为Real-time PCR方法15份、国标方法16份;阴性样本分别为Real-time PCR方法35份、国标方法34份。分析结果可知，建立的Real-time PCR检测灵敏度为87.5%，特异度为97.1%，准确度为94.0%。

3讨论

大肠杆菌O157：H7污染食品是食品安全事件的主因之一，各地区时有检出[9-10]。大肠杆菌O157：H7侵袭力极强，人类感染后出现出血性结肠炎、溶血性贫血、尿毒症等症状，因而我国及欧盟国家都明确规定不得检出[11-12]。传统微生物培养方法所耗时间长，PCR 技术近年来在检测致病微生物上是较为快捷、可靠的分子生物学检测方法，被广泛应用于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤害沙门氏菌等微生物的检测[13-15]。

Real-time PCR方法相较于PCR法能够将检测结果实现数据化，具有检测灵敏度高、特异性强等特点[16]。根据GenBank中所查询的大肠杆菌O157：H7菌株stx2（AF162758.1）、hlyA（U12572.1）、eaeA（U32312.1）毒力基因序列设计引物，扩增序列长度分别为522、386、279 bp，能够避免检测单一基因出现的假阳性，实现快速、准确检测需求。根据引物优化，该研究建立的3个毒力基因退火温度均为60 ℃，可以实现3对引物在同一反应管中扩增，其灵敏度为127 ng/mL。利用该研究建立的方法检测采集自贵阳市部分河流50份水样，在个别样本检测时有较小出入，但每组检测

结果一致。因此，该研究所建立的检测方法能够为检测大肠杆菌O157：H7提供理论支持。

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