古菌研究进展

邓霏

摘要从古菌的发现出发，综述古菌的分类、分布、系统进化关系、研究方法及现状，分析古菌发展存在的一些问题，对今后古菌发展的方向进行展望。

关键词古菌；分类；研究方法

中图分类号X172文献标识码

A文章编号0517-6611（2018）28-0011-04

Research Progress of Archaea

DENG Fei（College of Bioengineering and Technology，Tianshui Normal University，Tianshui ，Gansu 741000）

AbstractBased on finding of archaea，and the classification，the distribution，the phylogenetic relationship，research methods and current research situation were summarized.Problems of archaea development were analyzed，and the future development direction was proposed.

Key wordsArchaea；Classification；Research methods

古菌以其既不同于细菌也有别于真核生物的特点，在全球的生物地球化学作用中扮演着不可替代的角色。古菌研究对阐明生命运动的基本规律，揭示生命起源和物种进化，生物与生物、生物与环境的相互作用具有重要意义。

1古菌的发现

多年以来，人们认为地球上的生命形式只分为原核生物和真核生物。但在后续的研究过程中，人们从火山口、盐湖等高热、高盐、缺氧等极端环境下分离得到一些微生物，这些微生物中包含大量产甲烷的微生物，当时的科学家认为这些微生物可能是产甲烷的细菌，但发现这些微生物与已知的细菌有本质的区别。1977年Woese等[1]提出的16S rRNA生命树将这些微生物划归为新的生命类型——archaebacteria。他在比较了3类生物的小亚基核糖体RNA序列后，发现三域生物间的序列相似性都低于60%，而域内的序列相似性高于70% [2]，因而认为生命是由细菌域（Bacteria）、真核生物域（Eucarya）和古菌域（Archaea）组成，并在1990年首次提出三域学说，把自然界的生物分成不同的三大领域，并把archaebacteria改名为archaea，正式提出古菌概念[3]。

作为三域之一的生物，古菌有着特殊的性质。古菌细胞壁不含肽聚糖，细胞骨架由蛋白质或假肽聚糖构成，细胞膜由甘油分子和支链烃以醚键相连。古菌虽与细菌同为原核生物，但却与真核生物在进化树上具有更近的亲缘关系。例如，在遗传信息传递方面，古菌具有明显的真核生物特征。但在代谢过程中，如产能等方面却与细菌相似[4]。

古菌不仅存在于高温、高盐、缺氧、强酸、强碱等极端环境，也广泛存在于湖泊、海洋以及土壤等各种普通环境中，且含量巨大[5-6]，在全球地球化学循环中发挥着重要作用。例如海洋沉积物中的厌氧产甲烷古菌可将有机物降解为甲烷，对于海底甲烷的产生、存贮、转化甚至全球气候和全球碳循环等都有着不可估量的影响[7]。海洋浮游泉古菌能够利用可溶性无机碳作为碳源[8-9]，进而影响海洋碳循环。此外，有数据显示，在某些海洋和土壤环境中，氨氧化古菌（ammonia-oxidizing archaea，AOA）数量远大于氨氧化细菌（ammonia-oxidizing bacteria，AOB）[10-14]，在N循环中的作用更大。在多数已发现的海洋沉積物厌氧甲烷氧化环境中，硫酸盐的降解和甲烷的氧化有密切关系[15]，硫酸盐还原菌和甲烷氧化古菌可形成集团在对硫酸盐进行还原的同时对甲烷进行氧化[16]。

2古菌的分类、分布及其系统进化关系

根据16S rDNA序列将古菌分为5个不同的门类：奇古菌门[17]（Thaumarchaeota）、广古菌门（Euryarchaeota）、泉古菌门（Crenarchaeota）、纳古菌门（Nanoarchaeota）[18]和初生古菌门（Korarchaeota）[19-20]。目前发现的主要类群为奇古菌、广古菌和泉古菌。初生古菌和纳古菌目前均只发现1个种[19-20]。

与其他4个类群相比，广古菌（Euryarchaeota）多样性比较丰富，分布极其广泛。主要包括一些产甲烷菌（methanogens）、嗜热菌（thermophiles）和极端嗜盐菌（halophiles）。研究表明，在浅水环境中，广古菌的多样性和丰度更大[21-22]。广古菌中的一些嗜热古菌、产甲烷古菌、极端嗜盐古菌等都是可培养的古菌类群。

泉古菌（Crenarchaeota）最初是在极端环境下发现的一个古菌类群。很长一段时间以来，泉古菌一直被认为只存在于极端环境中，绝对厌氧并且依赖硫进行代谢。最初分离的泉古菌也都来源于海底热泉和热液区等地，但通过16S rDNA序列分析后发现，从低温环境和中温环境中均得到冷适应的泉古菌，这些序列构成泉古菌的新分支。这类冷适应泉古菌也被认为是地球上数目最大的原核生物之一。泉古菌的生存环境包括海洋、湖泊沉积物、土壤等。在深水环境中，泉古菌也是优势类群。近年来，基于对中温泉古菌基因组学、生理生态特征等的分析显示，中温泉古菌与泉古菌具有明显不同的特征。2008年Brochier-Armanet等[17]将中温泉古菌划分为一个新的门——Thaumarchaeota （奇古菌门） 。

迄今为止，纳古菌门（Nanoarchaeota）中只发现1个种——骑行纳古菌（Nanoarchaeumequitans），它是2002年科学家在冰岛的热泉口发现的，专性共生于另一种古菌燃球菌（Ignicoccus）上。纳古菌是目前发现的除病毒之外的基因组最小的生物[23]。

初生古菌门（Korarchaeota）是用分子生物学手段从美国黄石公园超热环境样品中检测到的一类古菌[19]，目前只通过FISH技术检测到它的存在，还未得到纯培养物[24]。这类古菌在进化上与中温古菌比较接近，但在生物学特性上与嗜热微生物有许多共同点。在古菌系统发育树中，初生古菌位于系统发育树的根部，这是生命热起源理论的又一理论依据[25]。

古菌的分布受多种因素的影响，特殊环境中往往生存着一些特殊类型的古菌。已有研究表明，高盐、高压、低温、冷泉、深海热液口或低营养等特殊的生境中生活着许多特殊的古菌[26]。除这些极端环境之外，非极端环境中的古菌的分布也表现出一定的规律。如王峰等[27]研究表明，西太平洋深海沉积物中古菌有明显的垂直分布特点；Hu等[28]研究表明，中国南海浮游泉古菌的丰度和群落结构随着海洋深度的变化呈现出有规律的变化趋势；Cruz-Martínez等[29]研究表明，不同季节降雨量的不同影响土壤古菌群落结构的变化。除上述因素外，环境中含氧量[30]、海水盐度[31]、原位水文、潮汐、波浪等[32]也能影响相应环境中古菌的多样性。

3古菌研究方法

目前，由于对古菌分离培养需要的温度、盐度、碳源、pH、是否需要生长因子以及所需生长因子的种类、是否需要与其他微生物共培养等都不是十分清楚，得到的古菌纯培养物十分稀少，因此需要借助不同的研究方法对古菌进行研究。目前，常用的研究方法主要包括以下几种。

3.1原位研究

原位研究是实验室最初加压等条件不成熟时常用的研究方法。试验时，可以预先用同位素进行标记，从而对不同位置及不同置入底物等条件下古菌生长机制进行研究[33]。虽然目前实验室条件有长足的进展，但由于原位研究的特殊性，仍然是海洋古菌尤其是深海古菌研究的一种常用手段。

3.2脂类结构研究

脂类是细胞膜的骨架成份，细胞膜将胞内物质与外界环境分隔开来，使单细胞生物形成一个微小的、独立的、相对稳定的系统。由于古菌的脂类结构相当稳定，所以脂类结构研究也是古菌研究的重要方法之一[5]。古菌之所以能够在高温、强酸、碱等条件下生存，是因为古菌脂类侧链的特殊结构。细菌等常见脂类侧链是以酯键和甘油酸分子相连，而古菌脂类侧链是以非常稳定的醚键与甘油酸分子相连，正是这种稳定的结构使得古菌死亡后其碳骨架还可以长期保存，通过测定古菌脂类结构即可揭示无法培养古菌的种类、分布以及演化等信息[34]。

3.3克隆文库的构建

克隆文库的构建是对样品中古菌的16S rRNA基因或相应的功能基因进行扩增，再将扩增纯化后的产物连接到载体上转入受体细胞，通过选择性培养后，对已插入的目的片段进行大量扩增，再通过测序、数据库比对等确定样品中古菌的系统发育地位。克隆文库可以很好地解决样品中古菌难培养或者含量非常低的问题，但由于其繁琐耗时，难以对古菌群落结构的动态变化进行实时监测。

3.4指纹图谱技术

常见的指纹图谱技术包括限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、末端限制性片段长度多态分析（T-RFLP）、变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）以及温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）等。RFLP技术是根据限制性核酸内切酶对不同DNA的序列进行特异性切割，得到不同长度和数量的DNA片段，再通过高分辨率的电泳得到特异电泳图谱，对不同酶切带型的序列进行测序分析，从而了解样品包含的古菌群落信息。T-RFLP是在RFLP的基础上发展来的，二者的不同在于T-RFLP在PCR引物的末端引入1个或2个荧光标记物质。与RFLP相比，T-RFLP可直接对混合的PCR产物进行酶切，且灵敏度更高，可以快速得到准确的数据化结果[35]。这2种方法在环境微生物多样性检测及群落结构的研究中已得到广泛应用。DGGE是指在尿素和甲酰胺等变性剂形成的连续变性梯度的凝胶中，加入双链的短片段PCR产物，不同G+C含量的DNA在相应浓度变性剂下部分解链，分子构象发生改变，从而影响其电泳迁移率，在凝胶中形成位置不同的谱带。因此，利用DGGE可以直接观察不同样品中古菌的多样性，也可从凝胶上切下谱带，通过测序分析样品中古菌的系统进化关系。TGGE的方法基本类似于DGGE，不同之处是利用温度梯度将不同G+C含量的DNA加以区分。目前，DGGE和TGGE技术已经广泛应用于微生物生态学的研究[36]，研究内容包括微生物的群落结构及随环境变化的动态变化、寻找环境中新的特异微生物、比较不同环境中微生物群落结构的差异等。

3.5高通量测序技术

高通量测序技术也称第2代测序技术或深度测序技术。与普通测序技术相比，高通量测序技术可获得海量数据，偏耗性低，运行成本也相对较低，理论上可以测出样品中全部的微生物。目前，广泛应运于环境样品微生物测序的方法主要有Roche的454、Illumina 的Solexa和Life technologies的SOLiD、Ion Torrent等[37]。Roche的454測序读长较长，错误率也相对较低（仅为0.38%），但运行成本高[38]。Illumina 的Solexa技术通量大，单位成本低，错误率也很低（HiSeq 和MiSeq 测序平台的错误率分别为0.26%和0.80%）[39]。虽然Illumina测序技术的单位读长相对较短，但目前已经通过双向测序（PE）可以达到2×250 bp，并且有望达到2×400 bp。Life technologies技术的突出优点是成本低，但其错误率较其他2种测序技术高，达到1.71%[40]，目前该技术的应用范围也较其他2种技术小。高通量测序技术突破传统培养方法的局限性，也帮助研究者跨过了克隆文库这一繁琐耗时的步骤，减少试验过程的偏差，通过后续生物信息学分析，能够快速高效完成测序任务。目前，高通量测序技术已被广泛应用于各种环境微生物群落的研究中，如耕地土壤[41]、南极苔原土壤[42]、海水[43]、人类消化道[44]以及海洋沉积物等环境[45-47]。

4古菌主要研究成果

随着分子生物学技术的不断进步和一些大型数据库的建立，如GenBank 、RDP（ribosomal RNA data base project）、Silva、Greengene等，以及一些分析软件的涉入，古菌16S rRNA基因及功能基因等方面的资料不断完善，这些都为古菌研究提供了基础数据[48]。目前，国际上对古菌的研究已取得许多重要的进展，同时也纠正了某些认识上的错误。例如，过去很长一段时间，人们认为海洋古菌只存在于3个特定的生境中：深海火山口、缺氧沉积物和高盐海区，但随着研究的不断深入，发现古菌虽受一定环境的制约，但其分布却是极其广泛的。

目前，国际上对古菌的研究主要集中在以下3个方面：一是极端环境下某些特殊古菌的研究。极端环境下的微生物是一个潜在的宝库，它们独特的基因组成、蛋白质结构以及细胞组分等都有可能对人类的生产生活产生重大影响。例如1997年Michels等[49]研究指出，Methanococcus jannaschii（一种深海嗜热嗜压菌）能够产生嗜壓蛋白酶，当压力增加至500个大气压时，该酶催化反应速率提高3.4倍，热稳定性提高2.7倍。二是古菌在地球化学循环中所起的作用。例如，海洋沉积物中的厌氧产甲烷古菌可将有机物降解为甲烷，对于海底甲烷的产生、存贮、转化甚至全球气候和碳循环等都有着不可估量的影响[7]。三是古菌群落结构与环境特征的相关关系。目前，虽然古菌群落与生物地球化学因素、沉积特点、地质事件等之间的关系尚不明确，但越来越多的研究表明，典型的古菌群落都反应出对特殊小生境的适应。例如在巴布亚新几内亚东北部高温、高盐的热液口环境中，古菌的群落结构与这种热液沉积物的环境非常一致[50]。日本海沟沉积物中的古菌群落结构也很符合这一地区沉积物孔隙大、渗透性强的特点[51]。

对功能性古菌——氨氧化古菌的研究也得到长足发展。长久以来，氨氧化细菌（AOB）被公认为是氨氧化过程的主要驱动者。2004 年，Venter等[52]用鸟枪法对马尾藻海中的宏基因组进行测序分析表明，海水中存在泉古菌的氨单加氧酶基因（ammonia monooxygenase，AMO）序列，首次提出海洋中某些泉古菌可能具有氨氧化的能力。2005 年，Knneke等[53]从海水中分离出一株具有amoA基因的奇古菌门的亚硝化侏儒菌（Nitrosopumilus maritimus），该菌株以氨为唯一能源物质进行自养生长，Francis等[54]将这类泉古菌命名为氨氧化古菌。后续的研究发现，amoA基因不只存在于海水环境中，土壤泉古菌中也存在amoA基因，有可能驱动土壤氨氧化过程[55]。2006年，Leininger 等[14]报道了土壤中氨氧化古菌可能是氨氧化细菌的3 000倍之多。此后陆续有研究报道海水[13]、农业土壤[56]、酸性茶园[57]等不同环境中氨氧化古菌amoA基因的拷贝数远大于氨氧化细菌，在氮循环过程中可能扮演着比氨氧化细菌更重要的角色。根据氨氧化古菌amoA基因序列和所处的生态环境，可将氨氧化古菌大致分为3类：陆地土壤/淡水沉积物氨氧化古菌族群、海水/海洋沉积物氨氧化古菌族群以及嗜高温环境氨氧化古菌族群[58-59]。目前，已在许多生境中发现氨氧化古菌的存在，这些生境包括海洋沉积物[60]、海水[54]、旱地红壤[61]、湿地[62]以及根际[63]等。总之，这些发现都证明氨氧化古菌的广泛存在及其在生物地球化学氮循环中可能起到举足轻重的作用。

5古菌研究存在的问题及其展望

5.1古菌纯培养物的获得

古菌纯培养物的获得仍是古菌研究发展的瓶颈问题[5]。由于人们对于古菌的培养条件还在摸索中，得到的纯培养物特别稀少。如果能得到较多的古菌纯培养物，就能够为16S rDNA测序和脂类分析提供标准依据，古菌研究将会进入一个崭新阶段。为了更早地摸清古菌纯培养的条件，要在现有条件下，尽可能多的了解古菌的生存环境及条件，找到控制不同古菌生长的最有利因素。

5.2分子生物学技术有待发展

分子生物学技术的发展为古菌的研究提供了很大的便捷，但是分子生物学技术在古菌研究上仍然存在许多缺陷。首先，核酸提取过程中部分细胞可能未完全裂解。其次，所设计的引物往往会漏掉所检测样品中的某些种类，即便是通用引物也可能存在片面性。再次，探针的设计，一般而言，探针具有物种特异性，是根据试验者预期的种属来设计的，这就意味着会忽略PCR产物的许多成分，很难兼顾到一些不为人知的种类。最后，人们往往会选择一定长度的PCR产物，这也不可避免地会遗失许多数据；并且模板的序列不同，克隆的效率也不同，比如低G+C含量的模板的克隆效率大大高于高G+C含量的模板，这就不可避免地会掩盖某些模板特性，甚至产生较大的错配、误配[64]。

尽管分子生物学技术存在诸多不足，但与传统试验方法相比，分子生物技术仍具有更大的精确度和适应性，相信不久的将来，随着试验方法的改进和科技工作者经验及数据的累积，分子生物学技术在古菌研究领域将扮演越来越重要的角色。

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