超高效液相色谱—质谱串联优化方法检测小麦脱氧麦根酸

樊庆琦 崔德周 郭钢

摘要 [目的]采用超高效液相色谱-质谱串联优化方法检测小麦脱氧麦根酸（DMA）。[方法]以山东省5个小麦品种为研究对象，利用超高效液相色谱-质谱联用（UPLC/ESI-MS）检测小麦苗期根系洗脱液的DMA。[结果]一级质谱分子离子峰m/z 305.2，二级质谱以正离子m/z 286.8和m/z 133.9进行定量，DMA标准品与小麦根系洗脱液的质谱图完全一致，因此，該方法可适用于大批量检测普通小麦根系洗脱液DMA。5个小麦品种在正常培养下，DMA分泌速率较低，但在缺铁胁迫下，DMA分泌速率呈极显著升高，增加6 242.86～62 833.42倍。[结论]小麦脱氧麦根酸UPLC/ESI-MS检测方法的建立，为深入研究其遗传机理提供了方法基础。

关键词 小麦；脱氧麦根酸；超高效液相色谱-质谱联用

中图分类号 S512.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）20-0155-04

Abstract [Objective] The research aimed to detect wheat deoxyger minic acid（DMA） by ultrahigh performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （UPLCMS/MS） serial optimization method.[Method]Five wheat varieties from Shandong Province were selected to study the DMA of root eluent in wheat seedling stage by UPLC/ESIMS.[Result] The first class mass spectrometry ion peak was m/z 305.2 and the second class mass spectrometry was quantified by positive ions m/z 286.8 and m/z 133.9. The standard product was identical with mass spectrum of wheat root eluent. Therefore， this method could be applied to mass detection of DMA in root eluent of common wheat. The DMA secretion rate of the five varieties was low under control treatment， but increased significantly under iron deficiency， which increased by 6 242.86-62 833.42 times. [Conclusion]The establishment of UPLC/ESIMS method for DMA detection in wheat provides a basis for the further study of its genetic mechanism.

Key words Wheat；Deoxygerminic acid（DMA）；UPLC/ESIMS

包括小麦在内的禾本科单子叶植物，根系能够合成麦根酸类物质（即植物铁载体，简称PS）并分泌至根系周围，螯合游离态的Fe3+，并经根系转运至体内满足生长发育必需的铁营养[1-2]。目前已明确，麦根酸类物质具有多种形式，L-甲硫氨酸作为合成前体，与ATP一起形成S-腺苷甲硫氨酸（SAM），3个分子的S-腺苷甲硫氨酸在尼克烟酰胺合成酶（NAs）催化下合成1个分子的尼克烟酰胺（NA），尼克烟酰胺在烟酰胺氨基转移酶（NAAT）等酶的催化作用下，形成脱氧麦根酸（DMA），进一步转化为麦根酸（MA）、阿凡酸（AVA）、羟基麦根酸（HMA）、3-表羟基麦根酸（epi-HMA）、3-表羟基脱氧麦根酸（epi-HDMA）等麦根酸类植物铁载体[3]。普通小麦主要以DMA为主[4-6]。

对于麦根酸类物质的定量检测，众多学者开展了大量的研究，提出了不同的检测方法。一类是根据麦根酸类物质与铁螯合的特性，通过比色法间接测量铁的活化量，经换算后得出PS的分泌率[7]；另一类是通过纸层析法[1，8-9]和高效液相色谱荧光方法等[10-13]。根据离子交换的原理，高效液相色谱检测又可分为阳离子交换[10-11]、离子对[12]和阴离子交换[13]等不同方法。高效液相色谱检测作为广泛采用的方法，需要对样品进行纯化浓缩等前处理，有时还需要柱后衍生等步骤，而且流动相较为复杂，单个样品的分析时间也较长，因此，并不适合进行大批量麦根酸类物质的检测。

近年来，有学者以水稻为研究对象，发展了利用超高效液相色谱-质谱对麦根酸类物质进行定量检测[14-15]，该方法具有灵敏度高、无需浓缩纯化等前处理步骤，具有高效、精确、快速的特点，可进行样品的高通量检测。笔者以普通小麦为研究对象，探索利用超高效液相色谱-质谱串联方法批量检测小麦苗期DMA分泌率，旨在为小麦麦根酸分泌的遗传规律和生理机制奠定方法基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

小麦材料为山东省审定小麦品种济麦22、烟农19、良星99、泰农18和山农22。脱氧麦根酸（DMA）标准品由加拿大TRC公司生产。

1.2 小麦苗期缺铁胁迫的营养液培养

挑选每份材料籽粒饱满的种子30粒，3次重复。种子经1.5%次氯酸钠消毒5 min 后，腹股沟朝下，均匀摆放至珍珠棉和纱网缝制的发芽盘，然后将其放入盛有1 L超纯水的培养盒（15 mm×15 mm×20 mm）中，在人工智能温室中发芽，光照16 h/8 h，光强12 000 lx，温度25 ℃，3 d换水1次。

种子发芽7 d后，仔细将种子从幼苗根部去除，加入培养液进行培养。其中，对照处理营养液配方为0.7 mmol/L K2SO4、0.1 mmol/L KCl、2 mmol/L Ca（NO3）2、0.5 mmol/L MgSO4、0.1 mmol/L KH2PO4、1 μmol/L H3BO4、0.5 μmol/L MnSO4、0.2 μmol/L CuSO4、0.5 μmol/L ZnSO4、0.01 μmol/L（NH4）6Mo7O24、100 μmol/L FeEDTA。缺铁胁迫营养液配方除无FeEDTA外，其余如对照处理。营养液3 d换1次，幼苗培养15 d后，进行麦根酸分泌的搜集。

幼苗在营养液中培养15 d后，挑选长相均匀粗壮的幼苗20株，超纯水冲洗3次，08：00将其放入盛有500 mL超纯水的烧杯中，进行麦根酸的搜集，搜集光强12 000 lx。搜集3 h后，将搜集液加入灭菌片处理5 min后，抽取50 mL存放至-40 ℃冰箱中作为待测液。根系则完整取下，烘干称重。

1.3 分泌的麦根酸质谱检测

1.3.1 药品和试剂。氨水（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲酸[色谱纯，阿沙埃莎（天津）化学有限公司]；甲醇、乙腈（色谱纯，美国飞世尔科技公司）。

1.3.2 仪器设备。

超高效液相色谱系统（LC-30A，日本岛津公司）；三重四级杆串联质谱仪（TripleQuad 4500），配带电喷雾离子源（ESI）及Analyst工作站，美国AB SCIEX公司；氮吹仪（JNC N-EVAPTM112型，美国Organomation 公司）；漩涡混合器（MS 3 型，德国IKA公司）；Milli-Q超纯水系统（Advantage A10型，美国Millipore 公司）；电子天平（BSA224S-CW，赛多利斯公司）；固相萃取装置（24位，美国Supelco公司）；Cleanert PCX 60 mg/3 mL Cartridge固相萃取小柱（天津博纳艾杰尔科技有限公司）；Thermo Scientific Hypersil GOLD柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm，美国飞世尔科技公司）。

1.3.3 色谱与质谱条件。

色谱柱：Hypersil Gold 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱温40 ℃，样品室温度4 ℃；进样体积5.0 μL；流动相A为0.2 % 甲酸-水，流动相B为乙腈；流速为0.4 mL/min，梯度洗脫。

离子源：电喷雾离子源（ESI），正离子模式；扫描方式：多反应监测扫描（MRM）；雾化气（TEM）温度：600 ℃；雾化气压力（GS1）：60 psi；辅助加热气压力（GS2）：55 psi；气帘气压力（CUR）：25 psi；喷雾电压（IS）：5 500 V；碰撞气体（CAD）：7 psi；驻留时间100 ms。

式中，X为样品中待测物残留量（μg/kg）；m为样品质量（g）；V为试样最终定容体积（mL）；C为根据标准工作曲线算出进样液的浓度（μg/L）。

1.3.5 样品处理。取5.0 mL缺铁营养液培养根系洗脱待测液稀释1倍，用甲酸调pH为2.5～3.0，以备UPLC/ESI-MS测定。

取20.0 mL正常营养液培养根系洗脱液，用甲酸调 pH为2.5～3.0，待提纯浓缩。步骤如下：PCX固相萃取柱依次使用3 mL 甲醇预洗活化，3 mL水平衡，加入酸化后的样品溶液，然后用3 mL水、3 mL甲醇依次淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液，用6 mL 2%氨化甲醇洗脱，收集洗脱液，40 ℃水浴下，氮气吹至近干，超纯水定容至1 mL，涡旋振荡，过0.22 μm微孔滤膜，以备UPLC/ESI-MS测定。

2 结果与分析

2.1 DMA分析方法的优化

2.1.1 固相萃取柱的选择。试验对C18固相萃取柱和PCX固相萃取柱的回收率进行了比较，前者的回收率低于10%，而后者的回收率在70%以上，这是因为麦根酸含有仲胺基，带正电荷，易与阳离子交换柱的磺酸基产生静电吸引作用而被吸附，最后通过碱性洗脱液中和叔胺基，降低离子交换作用而被洗脱出来。同时还发现，提取液的酸化对回收率影响较大，固相萃取柱上样前，应调节样品溶液pH为2.5～3.0。

2.1.2 质谱条件的优化。

麦根酸的化学结构如图1所示，它含有3个羧基，在水溶液中表现出弱酸性，易电离成负离子化合物，同时，它也含有叔胺基团。因此，麦根酸在酸性条件下呈现正电荷，在碱性条件下呈现负电荷。研究发现，在ESI-和ESI+模式下，后者的响应值明显高于前者。在ESI+模式下，样品具有离子化效率高、信号强的特点。因此，该试验采用正离子模式。

麦根酸的一级质谱和二级质谱如图2～3所示。一级质谱图中，分子离子峰为m/z 305.2。二级质谱麦根酸片段离子主要是两正离子m/z 133.9和m/z 286.8，因此，以这2个正离子作为定量分析的离子。标准品与小麦根系洗脱液的一级质谱和二级质谱完全相同，表明小麦根系洗脱液中的分泌物确为DMA。

2.2 标准曲线

配制5～200 μg/L系列标准溶液，以进样浓度（μg/L）为横坐标、定量离子对的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，获得的相关线性方程Y=2 001.3X-18.4，相关系数r=0.999 9。标准色谱图见图4。

2.3 方法的灵敏度、准确度和精密度

对空白水样品在10、50、200 μg/kg 3个浓度水平上进行添加，每个平行重复5次，进行提取净化，校正曲线定量。添加量、平均回收率和精密度见表1。结果表明，在添加量为10～200 μg/kg，平均回收率为77.2%～83.2%，相对标准偏差（RSD）为5.9%～15.0%。

2.4 麦根酸化学性质的稳定性

常温下，麦根酸化学性质不稳定，容易分解。因此，以标准品50、125和250 μg/L这3个浓度水平，在样品室4 ℃条件下，考察在0、3、6和10 h的浓度变化。结果表明（表2），在不同浓度梯度条件下，试验10 h后，每个浓度梯度均表现较好的化学稳定性，其变异系数在0.89%～1.87%。因此，麦根酸在4 ℃条件下，可保持较好的化学稳定性。

2.5 普通小麦DMA分泌速率

5个小麦品种在正常营养液和缺铁营养液培养，根据定量离子，经公式计算根系洗脱液DMA的含量，结果见表3。在正常营养液培养条件下，DMA分泌速率较低，为0.008 11～0.081 50 μg/（g·株·h）；但在缺铁胁迫条件下，DMA分泌速率为50.80～5 121.14 μg/（g·株·h），增加倍数在6 242.86～62 833.42。就增加倍数而言，5个小麦品种从大到小依次为山农22、良星99、泰农18、烟农19、济麦22，表明在缺铁胁迫下，山东省当前大面积推广品种均可以显著诱导DMA的大量分泌，以应对缺铁胁迫逆境。

3 讨论与结论

随着检测技术的发展，通过液相色谱-质谱联用进行单子叶禾本科作物的DMA测定，具有灵敏度高、简单快速、重复性好等特点[14-15]，特别适用于进行高通量DMA检测。所不同的是，Kakei等[14]首先利用衍生剂芴甲氧羰酰氯（Fmoc-Cl）与DMA螯合进行柱前衍生，pH调至8.0时信号最强，m/z为752。李金辉等[15]利用HPLC-MS/MS进行尼克酰胺（NA）的分析，NA与DMA化学式相比，前者比后者多1个氨基，而少2个羟基。一级质谱显示分子离子峰为m/z 304.43，而该研究的分子离子峰为m/z 305.2，结果基本一致，推测可能是由于不同仪器的误差所导致；二级质谱正离子峰m/z 286.52和m/z 185.17，该研究结果则为m/z 286.8和m/z 133.9，推测作为定量的2个正离子，1个可能完全相同，另1个离子则不相同，可能的原因是NA和DMA化学结构并不完全相同。总的来说，该研究的测定结果与李金辉等[15]的测定结果趋势一致。因此，可用液相色谱-质谱联用方法进行大批量小麦麦根酸类物质的分析测定。

在对根系洗脱液DMA进行浓缩纯化时，试验表明，随着添加量的增加，回收率呈增加趋势，说明在正常营养液培养的条件下，小麦品种普通存在DMA分泌量较低的现象，进行浓缩纯化可以提高试验精度。在缺铁胁迫的条件下，由于小麦植株感知缺铁信号，在体内大量合成分泌DMA，利用該方法，应稀释1～5倍后再进行试验，可取得良好的效果。

普通小麦根系DMA的合成与分泌，对植株生长发育所需的铁营养具有重要意义。目前，已在普通小麦中分离了编码314个氨基酸的DMA合成基因（TaDMAS1）[5]，该基因不但在根系中表达，还在芽细胞中表达。Bonneau等[16]还鉴定了21个小麦NA合成基因，明确了这些基因在种子萌芽期、苗期和生殖生长期进行表达。通过小麦DMA分泌方法的建立，有助于开展小麦DMA合成、分泌和信号传导等方面的研究。

参考文献

[1] TAKAGI S I.Naturally occurring ironchelating compounds in oatand riceroot washings[J].Soil science & plant nutrition，1976，22（4）：423-433.

[2] RMHELD V，MLLER C，MARSCHNER H.Localization and capacity of proton pumps in roots of intact sunflower plants[J].Plant physiology，1984，76（3）： 603-606.

[3] KOBAYASHI T，NAKANISHI H，NISHIZAWA N K.Recent insights into iron homeostasis and their application in gra minaceous crops[J].Proceedings of the Japan academy，2010，86（9）：900-913.

[4] MORI S.Iron acquisition by plants[J].Current opinion plant biology，1999，2（3）： 250-253.

[5] KOBAYASHI T，NISHIZAWA N K，MORI S.Molecular analysis of irondeficient Gra minaceous plants[M]// BARTON L L，ABADIA J.Iron nutrition in plants and rhizospheric microorganisms.Netherlands：Springer Verlag，2006： 395-435.

[6] UENO D，ROMBOL A D，IWASHITA T，et al.Identification of two novel phytosiderophores secreted by perennial grasses[J].New phytologist，2007，174（2）： 304-310.

[7] 于福同，张爱民，张福锁.小麦植物铁载体分泌基因的染色体定位[J].遗传学报：英文版， 1999（5）：552-557.

[8] KAWAI S，TAKAGI S，SATO Y. Mugineic acidfamily phytosiderophores in rootsecretions of barley， corn， and sorghum varieties[J].Plant nutrition，1988，11：633-642.

[9] TAKAGI S.Production of phytosiderophores[M]//BARTON L L，HEM MIN B C.Iron chelation in plants and soil microorganisms.New York：Academic Press，1993：111-131.

[10] KAWAI S，SATO Y，TAKAGI S，et al.Separation and deter mination of mugineic acid and its analogues by highperformance liquid chromatography[J].Journal of chromatography，1987， 391（1）：325-327.

[11] MORI S，NISHIZAWA N，KAWAI S，et al.Dynamic state of mugineic acid and analogous phytosiderophores in Fedeficient barley[J].J Plant Nutrition，1987，10：1003-1011.

[12] HIRADATE S，INOUE K.Deter mination of mugineic acid， 2deoxymugineic acid， 3hydroxymugineic acid， and their iron complexes by ionpair HPLC and colorimetric procedures[J]. Soil Sci Plant Nutrition，1996，42（3）：659-665.

[13] NEUMANN G，HAAKE C，RMHELD V.Improved HPLC method for deter mination of phytosiderophores in root washings and tissue extracts[J].Journal of plant nutrition，1999，22（9）：1389-1402.

[14] KAKEI Y，YAMAGUCHI I，KOBAYASHI T，et al.A highly sensitive， quick and simple quantification method for nicotiana mine and 2′deoxymugineic acid from minimum samples using LC/ESITOFMS achieves functional analysis of these components in plants[J].Plant & cell physiology， 2009，50（11）：1988-1993.

[15] 李金輝，蒋欣杭，吴世华.水稻尼克酰胺铁载体的高效液相色谱—电喷雾质谱分析[J].浙江农业学报，2013，25（1）：8-13.

[16] BONNEAU J，BAUMANN U，BEASLEY J，et al.Identification and molecular characterization of the nicotiana mine synthase gene family in bread wheat[J].Plant biotechnology journal，2016，14（12）：2228-2239.