基于COⅠ基因的主要经济头足类及其制品DNA条形码鉴定

周光东　邓尚贵　霍健聪

摘要[目的]建立快速高效的头足类物种鉴定方法。[方法]以细胞色素氧化酶亚基 Ⅰ（CO Ⅰ）基因作为该试验的DNA条形码，分别对冷冻头足类和头足类制品的成分来源进行鉴定。[结果]20份样品中18份能够扩增出特异性条带。通过NCBI数据库Blast工具比对和进化树分析发现，10份冷冻头足类样品的鉴定结果与形态学鉴定结果一致，初步鉴定10 份头足类制品样品中以柔鱼为主，有2个与商品标签不符，2份样品未能验证。[结论]DNA条形码是一项高效便捷的分子鉴定技术，可有效应用于头足类冻品及其成分相对单一制品的物种鉴定，为市售相关产品的监管提供较好的技术支持。

关键词DNA条形码；物种鉴别；头足类；CO Ⅰ基因

中图分类号S917.4文献标识码

A文章编号0517-6611（2018）28-0092-04

Identification of Main Economic Cephalopods and Products by DNA Barcoding Based on CO Ⅰ Gene

ZHOU Guangdong，DENG Shanggui，HUO Jiancong（School of Food and Medicine，Zhejiang Ocean University，Zhoushan，Zhejiang 316022）

Abstract[Objective]To establish a rapid and efficient method for the identification of cephalopod species.[Method]In this paper，the CO I gene was used as the general DNA barcoding of this test.The composition of the frozen cephalopods and products were identified respectively.[Result]Sepecific strapes were amplified by PCR in 18 out of 20 samples.The identification results of the ten frozen cephalopods were consistent with the morphological identification results，while the ten cephalopod products were mainly squit，and two were inconsistent with the commodity labels，two samples failed to verify.[Conclusion]DNA barcoding is an efficient and convenient molecular identification technology，which can be effectively applied to species identification of cephalopod frozen products and their relative single products，it provides better technical support for the supervision of related products on the market.

Key wordsDNA barcoding；Species identification；Cephalopods；CO I gene

头足类水产品是一种低脂高蛋白的健康食品，广受消费者的追捧。头足类种类繁多，由于产地、营养成分和滋味成分的差异，不同的头足类品种价格差距也十分明显。相较于普通水产品，头足类具有价格高、肉质相似、口感差別小等特性，其在加工后，一般消费者皆无法通过感官对产品的原料来源直接辨别，目前对于头足类产品也尚未形成成熟的监管体制。在价格悬殊、造假便利以及食品来源检测难度高的背景下，头足类产品的造假、掺假、标签乱贴成为了可能。

DNA条形码技术是近年来发展较为迅速的分子鉴定技术之一。DNA条形码概念由加拿大分类学家Paul Hebert提出，是指使用生物体内一条能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且序列较短的DNA片段，从而准确快速鉴定物种的方法[1-2]。DNA条形码可以理解为一种标准化指纹识别技术，检测人员只需将待测物种的标准DNA提取出来，与DNA条形码数据库进行对比，即可准确有效地判定待测样品的物种[3]。DNA条形码在国外是一项较为成熟的物种鉴定技术，早在2011年美国食品与药品管理局便正式批准了该技术在食品与药品领域的应用。而国内相关技术的研究较晚，且研究方向主要集中于珍贵药材等植物方向，有关水产品的研究尚处于起步阶段[2，4]。易啸等[5]利用CO Ⅰ基因分别对32种对虾的核苷酸组成、种间及种内遗传距离进行研究发现，即便是同一属内形态学特征相似且不易区分的对虾都能够通过DNA条形码得到有效的鉴别，基于CO Ⅰ基因的DNA条形码技术在对虾上取得了较好的应用。该研究将CO Ⅰ基因作为头足类的靶点，筛选通用引物，对头足类及其制品进行物种鉴别，以期建立准确高效的头足类鉴定方法，为食品溯源与食品安全监管提供技术支持和理论基础。

1材料与方法

1.1材料与试剂

冷冻头足类样品由舟山进出口检验检疫局提供，头足类制品（丸类、预包装类）分别从舟山国际水产城、超市及网上购买，将冷冻头足类样品置于-45 ℃冰箱中保存备用，预包装头足类制品置于常温条件下保存备用。

无水乙醇、异戊醇、氯化钠、氯仿，上海国药集团化学试剂有限公司；ddH2O、2×Taq DNA聚合酶、DNA Marker（DL2000）、GelRed核酸染料，上海生工生物工程有限公司；蛋白酶K，德国Merck公司。

1.2仪器与设备

冷冻离心机，德国Sigma公司；NanoPhotometerTM微量核酸蛋白测定仪，德国Implen公司；DYY-8C型电泳仪，北京六一仪器厂；2720型PCR仪，美国Applied Biosystems公司 ；凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1样品前处理。首先，对采集的样品进行编号，L1～L10皆为形态完整的冷冻头足类；Z1～Z10为头足类制品，其中Z1～Z3为冷冻鱿鱼圈，Z4～Z6为鱿鱼丝，Z7为墨鱼滑，Z8～Z10为墨鱼丸。

将头足类制品中油脂较高的样品（鱿鱼丝等）进行脱脂处理。用灭菌手术剪取5 g样品并剪碎置于50 mL离心管中，加入5 mL正己烷，涡旋30 s后于45 ℃恒温水浴锅中，水浴加热3 h；将离心管10 000 r/min离心5 min后弃上层油脂，加入15 mL 70%乙醇溶液涡旋2 min，10 000 r/min离心5 min，重复操作2～3次；加入无水乙醇15 mL涡旋2 min，10 000 r/min 离心10 min，弃上清液，并置于65 ℃恒温烘箱中烘干，研磨后保存备用[6]。

1.3.2头足类及其制品DNA提取。

1.3.2.1头足类。提取方法采用高盐法[7]。用灭菌手术剪取头足类样品100 mg于1.5 mL离心管中，加入 400 μL 裂解液（10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，20 mmol/L EDTA，400 mmol/L NaCl，2% SDS） 后剪碎；加入20 mg/mL蛋白酶K（20 mg/mL）1 μL，加入离心管中，涡旋30 s，充分均匀混合；将离心管插入塑料浮板上，置于60 ℃恒温水浴锅中，水浴加热8～10 h；冷却至室温后，加入 300 μL 6 mol/L 饱和NaCl溶液后，涡旋30 s，然后将其置于4 ℃冷冻离心机中，10 000 r/min 离心30 min；取上清液至新的离心管中，加入等体积（大约620 μL ）的异丙醇，混合均匀， -20 ℃ 冰箱中放置2 h后4 ℃ 冷冻离心机中以10 000 r/min 离心 5 min；弃上清液，加入70%乙醇溶液1 000 μL，充分混合后放入4 ℃ 冷冻离心机以10 000 r/min 离心5 min；弃上清液后，将离心管置于65 ℃恒温烘箱中烘干；加入 60 μL TE溶液，置于-20 ℃冰箱中。

1.3.2.2头足类制品。取50 mg经去油研磨的样品于1.5 mL离心管中，其余步骤同冷冻头足类DNA提取方法。

1.3.3DNA纯度及浓度测定。

取DNA模板2 μL，以去离子水作为空白对照，使用微量核酸蛋白测定仪测定样品DNA模板的质量浓度及A260/A280。根据DNA模板实际浓度稀释至50～100 ng/μL，保存備用。

1.3.4PCR扩增与测序。

参照文献中的序列，使用针对无脊椎动物的线粒体CO Ⅰ通用引物（表1），对样品的CO Ⅰ基因序列进行PCR扩增[8]，针对该引物无法扩增出特异性条带的样品，利用鱼类线粒体CO Ⅰ通用引物进行进一步鉴定。通用引物由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR反应体系：25 μL，2×Taq MasterMix（Dye）12.5 μL，模板DNA 1 μL（<10 ng），正、反向引物各1 μL（0.4 μmol/L），灭菌的双蒸水9.5 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 变性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，35个循环；72 ℃再延伸7 min。

PCR扩增结束后，通过混有核酸染料的1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物质量进行检测，并将条带清晰明亮且单一的产物送至上海生工生物工程进行正反双向测序。

1.3.5数据处理。

将生物公司反馈的原始数据用SeqMea程序去除两端杂峰和正反向引物序列后进行人工拼接，得到长度约为680 bp的CO Ⅰ基因序列，并用GenBank数据库中的Blast工具进行比对，根据序列相似度对样品的物种进行鉴别，并与商品标签比对，确认样品物种与标签是否一致。待测样品的多序列比对通过Clustal X进行，并利用MEGA 5.0软件计算种间与种内遗传距离，利用Neighbor Joining法构建进化树。

2结果与分析

2.1冷冻头足类鉴定分析

2.1.1冷冻头足类CO Ⅰ基因序列扩增。通过该研究所用引物扩增的目标片段长度大约为680 bp，待测样品的PCR产物在1%琼脂糖凝胶上的条带较为明亮且清晰单一（图1），说明该通用引物对头足类的通用性较高，可有效用于头足类CO Ⅰ基因的扩增。

2.1.2冷冻头足类CO Ⅰ基因测序结果分析。采集的10个样品为市场上较常见的冷冻头足类，由浙江海洋大学赵盛龙教授对其进行形态学鉴定，然后利用DNA条形码技术对鉴定结果进行验证。结果表明，DNA条形码鉴定结果与形态学鉴定结果一致，且CO Ⅰ序列与GenBank数据库中的物种相似度均大于91%（表2）。

通过Neighbor Joining法构建进化树，可对物种序列同源性较高的CO Ⅰ序列进行聚类分析，有助于进一步确认该序列所对应的物种，并判断不同种样品之间是否能够被有效区分。将10份样品的序列与从GenBank数据库下载的30条对应物种序列构建进化树，以1 000次自展分支检验（Boot-straps test）。由图2可知，不同属的头足类能够以其所属的特性相互聚类，并被分为两大分支，其中柔鱼科的太平洋褶柔鱼、鸢乌贼、茎柔鱼、柔鱼相互聚成一个大支，节点支持率为76%；剩余6种头足类相互聚为另一个大支。以上10种头足类均可形成独立的分支，说明DNA条形码技术能够将以上物种准确鉴别。

2.2頭足类制品鉴定分析

2.2.1头足类制品CO Ⅰ基因序列扩增。

加热和氧化是导致DNA降解的主要因素[9-10]。鱿鱼丝相关制品的焙烤处理条件一般为75～85 ℃，3～5 min；丸类等相关制品的煮制处理条件一般为80～90 ℃，15～20 min[11-12]。头足类制品在加工过程中可能会使DNA严重降解。通过试验发现，短时间的加热不足以破坏头足类的所有线粒体DNA，而长时间的加热处理对头足类的DNA影响较大。

2.2.2头足类制品CO Ⅰ基因测序结果分析。在GenBenk数据库中对10个样品的CO Ⅰ基因序列进行比对，结果表明绝大多数头足类制品来源与商品标签符合（表3）。其中墨鱼类制品来源与标签不符合的情况较为突出，存在将柔鱼甚至是鱼类作为原料加工的情况；有2份样品未能成功扩增特异性条带，均为丸类制品，可能是 DNA降解严重或其不含头足类成分，需要设计新的短序列引物进行鉴定，有待进一步试验验证。

3结论与讨论

该研究选取了冷冻头足类和头足类制品两类样品进行物种鉴定，基于CO Ⅰ基因的DNA条形码在冷冻头足类物种鉴定方面得到了良好的效果，大部分样品能够达到鉴定到种的目标，而有部分头足类制品不能够达到鉴定的目标，具体原因分析如下：①丸类制品在加工过程中需要将头足类制成肉糜，期间剪切力和氧化作用可能会对DNA造成较大的破坏，且长时间的高温蒸煮也会对DNA的完整性造成较大的影

响，考虑设计短序列引物，利用微条形码对未能成功鉴定的样品进行进一步研究[13]；②能够利用DNA条形码鉴定的待测样品基本都是未经加工的冷冻头足类与鱿鱼丝等制品，其成分较为单一，而墨鱼丸、鱿米花等头足类制品中含有鱼肉、鸡肉等多种成分，考虑后期设计多重引物对其进行鉴定；③头足类制品加工过程中添加了植物油以及食品添加剂等物质，样品预处理时未能将其完全除去，可能会降低DNA的提取率或抑制PCR反应。因此，DNA条形码技术在头足类食品中的应用存在一定的局限性，适用于头足类初加工品或加工条件相对较为温和、成分单一的头足类制品。

DNA条形码技术在鱼、虾、蟹等渔类资源中的应用日趋成熟。Eugenehk等[14]在利用条形码对91种海产品的检测中发现25%的海产品存在商品标签错误的现象，并认为DNA是一种可将海产品鉴定到种的较为经济高效的鉴定技术；Haye等[15]基于DNA条形码技术对智利市售螃蟹制品鉴定中发现其中一种产品与商品标签不符，表明DNA条形码是一种能够用于规范螃蟹制品加工和销售的技术。渔类产品DNA条形码技术的发展得益于DNA条形码数据库的不断扩大，尤其是鱼类DNA条形码数据，早在2014年FISH-BOL数据库便已收录了多达10 267种鱼类的75 249条。DNA条形码技术从分子水平对头足类进行检测，范围更为广泛，鉴定结果更加精确，将其应用于市场上商品标签与实物不符的头足类产品是对水产品市场规范的一项革新。

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