烟草半胱氨酸蛋白酶的生物学分析

马世明 罗家佐 王德勋 户艳霞 范志勇 苏家恩

摘要 [目的]研究烟草半胱氨酸蛋白酶的生物学特性。[方法]通过PROTPARAM、CLUSTAL、MEGA、TMHMM、WOLF-PSORT、SOPMA工具对烟草半胱氨酸蛋白酶的理化特性、进化树和跨膜结构进行生物学分析。[结果]NtCP-3和NtCP-4氨基酸个数（361）最大，NtCP-5氨基酸个数（349）最小；NtCP-1、NtCP-2、NtCP-3和NtCP-4为酸性，NtCP-5为碱性；NtCP均属于稳定性蛋白，且NtCP-1和NtCP-2的耐热性较好；NtCP-3和NtCP-4属于亲水性蛋白，其余为两性蛋白；NtCP被分为3个亚组，NtCP-1和NtCP-2为一组，NtCP-3和NtCP-4为一组，NtCP-5单独成一组；NtCP均属于跨膜蛋白，且NtCP-5具有2个跨膜结构。[结论]烟草半胱氨酸蛋白酶的生物学特性为广泛地参与烟草的生理反应奠定基础。

关键词 烟草；半胱氨酸蛋白酶；生物学

中图分类号 S188文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）16-0017-03

Abstract [Objective] The research aimed to study the biological characteristics of tobacco cysteine protease. [Method]The physical and chemical properties， phylogenetic tree and transmembrane structure of tobacco cysteine protease were analyzed by using PROTPARAM， CLUSTAL， MEGA， TMHMM， WOLFPSORT and SOPMA respectively.[Result]The amino acid numbers of NtCP3 and NtCP4 were the largest （361）， and the NtCP5 amino acid number was the smallest （349）；NtCP1， NtCP2， NtCP3 and NtCP4 were acidic， and NtCP5 was alkaline；NtCP belonged to the stability protein， and the heat resistance of NtCP1 and NtCP2 were better；NtCP3 and NtCP4 were hydrophilic proteins， and the rest were amphoteric proteins；NtCP was divided into three subgroups， NtCP1 and NtCP2 were one group， NtCP3 and NtCP4 were a group， and NtCP5 was a single group；NtCP belonged to transmembrane protein， and NtCP5 had 2 transmembrane structures.[Conclusion]The biological characteristics of tobacco cysteine protease laid the foundation for extensively participating in the physiological response of tobacco.

Key words Tobacco；Cysteine protease；Biology

半胱氨酸蛋白酶属于水解蛋白酶类的一部分，催化底物反应[1]，在植物的部分生理反应时参与其中，如储存蛋白于细胞中的沉淀[2]，或动员及降解[3-4]；抵抗或缓解非生物胁迫（盐胁迫、干旱和损伤等）[1，5-6]、生物胁迫（病菌侵染）[7-8]；参与植物细胞的衰老和程序性的死亡[9-10]。近年来，关于半胱氨酸蛋白酶的生物学研究主要集中在草莓[11]、番木瓜[12]、西瓜[13]等，而有关烟草半胱氨酸蛋白酶的生物学特性研究鲜见报道。笔者通过鉴定烟草半胱氨酸蛋白酶理化特性、分析各成员的进化树和跨膜结构，为初步研究烟草半胱氨酸蛋白酶的特性提供依据。

1 材料与方法

1.1 烟草半胱氨酸蛋白酶家族成员的获取

通过美国NCBI数据库[14]，获取烟草半胱氨酸蛋白酶的蛋白序列，其登录号分别为ABW71226.1、BAA96501.1、ACB70409.1、AAW78660.1和ADV41672.1，并分别对其进行命名NtCP-1、NtCP-2、NtCP-3、NtCP-4和NtCP-5[15]。

1.2 方法

以理化特性PROTPARAM的工具[16]，對烟草半胱氨酸蛋白酶的氨基酸数、分子量、理论等电点、不稳定指数、脂肪族指数和亲水性进行分析；以CLUSTAL和MEGA工具[17-18]对成员进行进化树分析；以TMHMM工具[19-20]分析各成员的跨膜结构。

2 结果与分析

2.1 烟草半胱氨酸蛋白酶的理化特性分析

运用PROTPARAM对NtCP进行相关理化特性分析，结果发现（表1），NtCP-1和NtCP-2的氨基酸数相等，均为360个，NtCP-3和NtCP-4均为361个氨基酸，NtCP-5为349个氨基酸；分子量较大的蛋白为NtCP-4，而NtCP-5的分子量最小；经过烟草半胱氨酸蛋白酶的等电点测定，NtCP的酸碱性存在分化，NtCP-1、NtCP-2、NtCP-3和NtCP-4均呈现酸性，且NtCP-3和NtCP-4的酸性相对较强，NtCP-5呈现碱性；NtCP-3和NtCP-4的不稳定指数相对较大，但均小于40，即NtCP均属于稳定性蛋白；NtCP-1和NtCP-2的脂肪指数较大，即NtCP-1和NtCP-2的耐热性较好；NtCP-3和NtCP-4的亲水性平均指数均小于-0.5，即NtCP-3和NtCP-4属于亲水性蛋白，NtCP-1、NtCP-2和NtCP-5的值大于-0.5，且小于0.5，则NtCP-1、NtCP-2和NtCP-5属于两性蛋白质。

2.2 煙草半胱氨酸蛋白酶的进化树分析

运用NtCP的氨基酸序列与玉米和番茄的半胱氨酸蛋白酶的氨基酸序列进行同源比对，并构建进化树，结果如图1所示。根据同源性，可将NtCP分为3个类别：第1类为NtCP-1和NtCP-2与玉米的CAA68192的同源性最大，其值为100%；第2类为NtCP-3 和NtCP-4与番茄的CEL26633同源性较大，其同源性为85%；第3类为NtCP-5与玉米的ONL99021和ABW97700，以及番茄的AAM19209、AFP73354和AFP73353的同源最大（88%），表明烟草中的NtCP-1和NtCP-2聚成一类，NtCP-3和NtCP-4聚成另一类，NtCP-5为一类。通过进化树分析，说明烟草的NtCP具有多种保守性序列，每个NtCP具有特异的保守性序列，且该蛋白酶的进化与玉米和番茄的进化较为相似，NtCP-1和NtCP-2与NtCP-3、NtCP-4、NtCP-5的分化时间较长。

2.3 烟草半胱氨酸蛋白酶的跨膜结构分析

由于蛋白的跨膜结构存在，有利于蛋白锚定于质膜上，进而在特定的位置发挥作用。因此，对NtCP进行跨膜结构的预测，详情如图2。

从图2可看出，NtCP各成员均包含多个跨膜螺旋域，NtCP-1和NtCP-2共同具有3个从内向外的跨膜螺旋域，分别处于164～184位（score=321）、198～216位（score=153）、343～360位（score=92）的氨基酸，其特有的分别为4～29（score=2 391）、6～22（score=2 219），而从外向内共有的跨膜螺旋域为2个，分别处于195～215（score=7）、305～325（score=464），其特有的分别为6～29（score=2 220）、6～22（score=2 219）；NtCP-3和NtCP-4共同具有3个从内向外的跨膜螺旋域，分别为4～21（score=1 229）、147～165（score=424）、251～271（score=76），从外向内共有的跨膜螺旋域为1个148～165（score=127），其特有的分别为4～21（score=913）、3～19（score=810）；NtCP-5从内向外的跨膜螺旋域为3个，分别为3～22（score=2193）、151～168（score=214）和274～294（score=872），从外向内的跨膜螺旋域为2个，分别为6～24（score=1 829）和274～294（score=761）。当score > 500时，蛋白序列存在跨膜结构的可能性较大。综上所述，NtCP-1、NtCP-2、NtCP-3和NtCP-4均具有1个跨膜结构，分别位于相应序列的第4～29、6～22、4～21和4～19位氨基酸；NtCP-5具有2个跨膜结构（6～22和274～294）。

3 结论与讨论

通过检测烟草半胱氨酸蛋白酶的等电点，NtCP-1、NtCP-2、NtCP-3和NtCP-4呈酸性，NtCP-5呈碱性，有利于NtCP在酸碱环境保持活性，且NtCP均属于稳定性蛋白，进而为其广泛地参与植物的生理反应提供保障[21]；NtCP-1和NtCP-2的热稳定性较强，且属于两性蛋白质，即有利于NtCP-1和NtCP-2参与较多的生理反应；通过进化树分析，NtCP被分为3个亚组，表明烟草半胱氨酸蛋白酶在进化的过程中发生分化，进而分化为不同类型的蛋白家族（Papain、legumain、caspase、calpain）[1-2，22-23]；烟草半胱氨酸蛋白酶均含有跨膜结构，且均位于蛋白序列的N端，表明NtCP属于跨膜蛋白，进而有助于膜外的N端接受信号，作用于效应区域（蛋白序列的C端），从而发挥作用[24]。

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