西南地区民族习用药香龙肝香（杠香）的品种鉴定

张丹雁 范紫颖 马换换 林如意 赵维波 梁耀勇 李伟

摘要 [目的]鉴定云川贵民族习用药香龙肝香（杠香）的原植物品种，保护和开发民族药用新资源。[方法]实地调研、采访，采集龙肝香（杠香）原植物，收集标本，用基原鉴定法、性状鉴定法以及DNA条形码技术鉴别龙肝香（杠香）原植物品种。 [结果]龙肝香（杠香）的藤本植物形态、香药材性状特征及DNA条形码特征与豆科蝶形花亚科黃檀属植物滇黔黄檀（Dalbergia yunnanensis Franch.）相吻合。[结论]云川贵民族习用药香龙肝香（杠香）来源于豆科蝶形花亚科黄檀属植物滇黔黄檀富含树脂的木质藤茎。

关键词 龙肝香；杠香；药香；滇黔黄檀；品种鉴定

中图分类号 R282.71文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）16-0011-03

Abstract [Objective] The research aimed to identify original plant variety of Longganxiang （Gangxiang） which was conventionally used as medicine and spice in Yunnan，Sichuan，Guizhou Province，and to provide basis for protection and development of new medicinal resources for the nation. [Methods] Field surveys，interviews and collection of the original plants of Longganxiang （Gangxiang），and to collect the plant samples. Next，germplasm origin identification method，character identification method and DNA barcode technology was used to identify the original plant varieties of Longganxiang（Gangxiang）. [Result] The morphological characteristics，macroscopic characters and DNA barcode information of Longganxiang （Gangxiang） were accordant with Dalbergia yunnanensis Franch.. [Conclusion] Longganxiang （Gangxiang） which conventionally used in Yunnan，Sichuan，Guizhou Province was derived from Dalbergia yunnanensis Franch. resinrich woody cane.

Key words Longganxiang；Gangxiang；Chinese medicine and spices；Dalbergia yunnanensis Franch.；Variety identification

长期以来，云南、四川及贵州等地少数民族在袭用一种名为龙肝香、杠香、藤香、秧青、紫降及云香等称谓的富含树脂的藤本木质香材作为心血管、胃肠道及外伤常见疾病防治的民间药，以及道观祭祀香料，具悠久的药用及香用历史。此外，龙肝香（杠香）木质致密、花纹美观，气味芳香怡人，亦深受香道广大爱好者的青睐，并开始盛行于香料文玩市场。龙肝香（杠香）作为西南少数民族地区药香两用原料，其原植物广泛分布于云南、四川、贵州及广西等地，资源丰富，然而这个被当地民众和香佛文玩工艺市场大量使用的藤类香材究竟来源于何物种，至今尚未明确，且名称颇多，各地叫法混乱。鉴于龙肝香（杠香）独特的香药两用价值，为挖掘和开发民间药用新资源，笔者通过实地考察，收集香材原植物标本，对其进行物种鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材。

龙肝香（杠香）原植物及其香材采自云南省大理市及龙陵县山区；样品均保存于广州中医药大学中药鉴定教研室。

1.1.2 试剂。天根植物基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司，DP305]；Goldview（Life Technologies，美国）；Agarse（Life Technologies，美国）；6×Loading buffer（Thermo，美国）；PrimeSTAR HS Premix（TaKaRa，大连）；DL2000 DNA Marker（Bioteke，北京）；rbcL序列引物（由深圳华大基因科技有限公司合成）。

1.1.3 仪器。1-15型台式高速离心机（德国Sigma有限公司，德国）；T100型PCR扩增仪（美国伯乐有限公司）；JY1000C电泳仪（上海京工实业有限公司）；K-WHS型数显恒温水浴锅（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）；Eppendorf Research plus微量移液器（艾本德中国有限公司）；Precisa XS 125A型电子分析天平（瑞士Precisa有限公司）；Lab Dancer/MS3型涡旋混合仪（德国IKA有限公司）；HR-220型掌上离心机（北京鼎昊源科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 基原鉴定及性状鉴定。通过实地调研、采访，观察龙肝香（杠香）原植物生长状况和形态特征，采集标本并记录描述其形态及香材性状特征，鉴定原植物品种。

1.2.2 DNA条形码鉴别。

1.2.2.1 样品前处理。将采集得到的新鲜叶片迅速置入装有变色硅胶的密封袋中，以使尽量干燥完全。

1.2.2.2 样品DNA提取。提取方法参照植物天根DP305基因组DNA提取试剂盒操作指南进行部分调整：①取经硅胶干燥后的叶片30 mg，加入等量石英砂，充分研磨。②将研磨好的粉末迅速转移到预先装有800 μL 65 ℃预热缓冲液GP1的离心管中（试验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65 ℃水浴20 min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。③加入800 μL氯仿，充分混匀，12 000 r/min 离心5 min。④将上一步所得上层水相转入新离心管中，加入800 μL缓冲液GP2，充分混匀。⑤将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12 000 r/min 离心30 s，弃掉废液。⑥向吸附柱CB3中加入500 μL缓冲液GD，12 000 r/min离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。⑦向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW，12 000 r/min离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。⑧重复操作步骤⑦。⑨将吸附柱CB3放回收集管中，12 000 r/min离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。⑩将吸附柱CB3转入离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50 μL洗脱缓冲液TE，室温放置5 min，12 000 r/min离心2 min，将溶液收集到离心管中。B11重复步骤⑩。B12将收集到的共100 μL 洗脱缓冲液TE加入到吸附柱CB3中，室温放置5 min，12 000 r/min离心2 min，以提高DNA收率。

1.2.2.3 PCR扩增体系及扩增反应程序。PCR扩增体系为rbcl正向引物及反向引物各1 μL，DNA模板4 μL，蒸馏水19 μL，DNA聚合酶25 μL。扩增反应程序为预变性温度94 ℃，时间120 s；变性温度98 ℃，时间10 s；退火温度55 ℃；延伸温度72 ℃，时间30 s；以上程序进行40个循环；最后延伸温度为72 ℃，时间为300 s；最终保存温度为4 ℃。

1.2.2.4 电泳检测。上样量：PCR产物 5 μL；Marker 3 μL。电泳条件：100 V，400 mA，30 min。

1.2.2.5 测序及分析。PCR样品送样30 μL，正向引物rbcLa-F送样15 μL，交由深圳华大基因科技有限公司进行测序。测序结果使用GeneBank进行在线Blast。

2 结果与分析

2.1 基源鉴别

大藤本，有时呈大灌木或小乔木状，小枝呈螺旋状或钩状。羽状复叶，叶轴被微柔毛；小叶13～25片，近革质，长圆形或椭圆状长圆形，先端微凹或钝，葉表面具锈色稀疏毛，背面毛多，密集于中脉。叶干后背面粉白，边缘反卷，多角形脉岛细小且清晰。聚伞花序顶生或生于上部叶腋，花序梗与花梗被微柔毛。花稍密集，小苞片卵形，花萼钟状，花冠白色，旗瓣阔倒卵状长圆形，先端稍凹缺，基部具阔短瓣柄，翼瓣狭倒卵状长圆形，无耳，龙骨瓣近半月形，内侧具耳，与翼瓣同具狭长瓣柄。雄蕊9，子房无毛或被微柔毛，花柱短。荚果薄革质，长圆形或椭圆形，种子部分具明显网纹，种子多数1粒，少见2～3粒，肾形（图1）。花期4—5月。

2.2 性状鉴别

香材外皮脱落，木部呈圆柱形、扁块状或不规则块状，表面呈黄棕色、红棕色至棕黑色，有时残留条形或块状黄白色木部，形成深浅不一的花纹，偶见棕黑色发亮树脂斑及长圆形凹窝（香眼），土埋者棕色或褐色，通体附着红色细粉。木质坚硬致密，断面具同心环状或辐射状黄棕、红棕、棕褐色等花纹，偶见中空（图2）。气芳香，味微苦辛、微涩，回甘，火烧冒黑烟，渗油，香气四溢。

2.3 PCR扩增结果

龙肝香（杠香）PCR扩增出单一清晰的目标条带（如图3所示，rbcL序列约为600 bp），表明PCR体系及扩增条件对模板DNA扩增效果理想，特异性高，适用于该试验龙肝香（杠香）模板DNA的PCR扩增研究。

2.4 测序结果与分析

龙肝香（杠香）rbcl基因序列经深圳华大基因科技有限公司测序分析，所得rbcl序列为：CGAC

CGTAATTCTTAGCGGATAACCCCAATTTCGGTTTAATAGTAC

ATCCCAATAGGGGACGGCCATACTTGTTTAATTTATCTCTTT

CAACTTGGATACCGTGAGGCGGACCTTGGAAAGTTTTAACA

TAAGAAGTAGGGATTCGCAAATCTTCCAGACGTAGGGCGCG

CAGGGCCTTGAACCCAAATACATTACCTACAATGGAAGTAA

ACATGTTAGTAACAGAACCTTCTTCAAAAAGGTCTAAGGGA

TAAGCTACATAAGCAATATATTGATTTTCTTCTCCAGCAACG

GGCTCGATGTTGTAGCATCGTCCTTTGTAACGATCAAGACT

GGTAAGCCCATCGGTCCAAACGGTTGTCCATGTACCAGTAG

AAGATTCGGCAGCTACCGCGGCACCCGCTTCTTCAGGAGGA

ACTCCAGGTTGAGGAGTTACTCGGAATGCGGCCAAGATATC

AGTATCTTTCGTTTCATAGTCAGGAGTATAATAATTCAATTT

ATAATCTTTAACACCAGCTTTGAACCCAACACTTGCTTTAGT

CTCTGTTGGGGGGGAGCCTATA。

上述rbcl序列的在线Blast结果与GeneBank中滇黔黄檀（Dalbergia yunnanensis Franch.）rbcl序列的相似度为100%，E值为0。滇黔黄檀rbcl序列GeneBank登陆号为KM458233.1。近年来，DNA分子鉴定被广泛应用于中药材动植物基源的鉴定[1-7]，具有较高的专一性和科学性。陈士林[8]研究得出，GeneBank在线匹配结果相似性高于95%时，可判断为同源。上述样品的rbcl序列与GeneBank中滇黔黄檀相似度为100%，表明样品为豆科蝶形花亚科黄檀属植物滇黔黄檀（D.yunnanensis Franch.）。

3 结论与讨论

该试验与在线Blast结果匹配时，除与滇黔黄檀的相似度为100%外，与多裂黄檀和印度黄檀匹配度亦较高，但印度黄檀为乔木，可予排除，鉴于龙肝香（杠香）原植物与多裂黄檀藤本植物形态差异较大（前者为大藤本，小叶数目13～25对，后者为藤本，小叶数目2～4对），故结合植物形态、香材外观性状特征及DNA条形码特征，可判定龙肝香（杠香）原植物为豆科蝶形花亚科黄檀属植物滇黔黄檀（D.yunnanensis Franch.）。现版《中国植物志》[9]收载了滇黔黄檀（原变种）（D.yunnanensis Franch.）及其变种高原黄檀（D.yunnanensis var.collettii），经黄檀属植物学家李世晋等[10]实地考察证明两者实为同一物种在不同生态环境下的不同形态，并将两者进行归并，统称为滇黔黄檀（D.yunnanensis Franch.），且新的英文版中国植物志（Flora of China）亦将高原黄檀归并为滇黔黄檀，故滇黔黄檀不再有原变种后缀说明。

滇黔黄檀药香两用历史已久，在多部地方史料中均有记载。其中《西昌中草药》[11]记载“杠香”为西昌地区常用中草药，其基源为蝶形花亚科黄檀属植物云南黄檀（D.yunnanensis Franch.），说明“杠香”早期的原植物名与现今原植物名滇黔黄檀有异，但拉丁学名一致，因此“杠香”与龙肝香实为同物异名。

龙肝香（杠香）来源于豆科蝶形花亚科黄檀属植物滇黔黄檀（D.yunnanensis Franch.）富含树脂的木质藤茎，为云川贵少数民族习用香药，该研究对其进行的原植物品种鉴定为药用新资源滇黔黄檀的开发奠定了基础。

龙肝香（杠香）具有较高的香药两用经济价值和应用前景，尤其是其药用历史悠久，因此云贵川龙肝香（杠香）作为当地香料和未来药用资源，应给予合理的开发和应用，其所含的化学成分及药效作用物質基础有待今后进一步研究。

参考文献

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