泥鳅皮肤出血病的病原与治疗研究

姜守松 唐庆权 陶敏慧 徐婷婷 毛颖睿 张子涵 鲁子怡 樊慧敏 许晓牧 彭开松 朱若林 鲍传和 薛贵胜 李明

摘要 [目的]探明泥鳅皮肤出血病的病原，并筛选有效的外用和内服药物。[方法]进行了细菌分离鉴定、毒力基因检测、人工感染、药物筛选和治疗试验。[结果]分离的N-1、N-2和N-3株均为凡隆气单胞菌，且携带气溶素aerA、细胞毒性肠毒素Act、热不稳定性肠毒素Alt、丝氨酸蛋白酶Ser等毒力基因。N-1株注射泥鳅的半数致死浓度为2.2×106 CFU/尾，并复制出体表点状出血症状。外用和内服药分别优先选择优力克和氟苯尼考。 [结论]凡隆气单胞菌可引起泥鳅皮肤出血病，优力克泼洒和氟苯尼考内服可治疗该病。

关键词 泥鳅；皮肤出血；凡隆气单胞菌；优力克；氟苯尼考

中图分类号 S947 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）27-0088-03

Pathogen and Treatment of Skin Hemorrhage in Loach

JIANG Shousong1， TANG Qingquan2， TAO Minhui2 et al

（1. Dingyuan Water Bureau， Dingyuan， Anhui 233200；2. Laboratory of Aquatic Health and Public Health， School of Animal Science and Technology， Anhui Agricultural University， Hefei， Anhui 230036）

Abstract [Objective]To identify the pathogen of loach skin hemorrhagic disease and screen for effective external and internal medicine. [Method]Bacterial isolation and identification， virulence gene detection， artificial infection， drug screening and treatment tests were carried out. [Result]The isolated N1， N2 and N3 strains were Aeromonas veronii and carried virulent genes such as aerolysin， cytotoxic enterotoxin， thermal unstable enterotoxin and serine protease. The median lethal concentration of N1 strain injected into loach was 2.2×106 CFU/fish， and the body surface punctate bleeding was detected. Topical and internal medication were given priority to the selection of Youlike and florfenicol respectively. [Conclusion]Aeromonas veronii can cause loach cutaneous hemorrhage， Youlike and florfenicol can be used to treat this disease.

Key words Loach；Skin hemorrhage；Aeromonas veronii；Youlike；Florfenicol

基金项目 安徽省重点研究与开发计划项目（1804g07020174）；安徽省現代农业产业技术体系（皖农科〔2016〕84号）；定远县现代农业推广中心专项。

作者简介 姜守松（1973—），男，安徽定远人，工程师，从事水产技术推广、水生动物疾病监测与防控、水产品质量安全监管工作。*通讯作者，副教授，博士，从事养殖健康与公共卫生研究。

收稿日期 2018-08-23

泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus），俗称青鳅，是鲤形目鳅科泥鳅属的小型食用和药用淡水鱼类，近年国内外市场需求年年攀升，是我国外贸出口的重要水产品之一 [1]。泥鳅耐低氧，适合高密度精养，但高密度养殖容易暴发细菌性疾病。现有报道表明，可引起泥鳅疾病的细菌包括温和气单胞菌[2]、凡隆气单胞菌[3]、泥鳅气单胞菌[4]、霍乱弧菌和希瓦氏菌[5]，以气单胞菌科成员最为常见。气单胞菌科（Aeromonadaceae）气单胞菌属（Aeromonas）的成员广泛分布于水体、土壤等自然环境中，可分为致病株和非致病株，前者可感染几乎所有动物门类，是淡水水生动物的重要病原菌和重要新发人-兽-鱼共患病[6-7]。

2017年8月安徽省定远县明源水产养殖专业合作社养殖基地的泥鳅发生零星死亡，临床以体表点状出血为特征。为探明该病的病因和寻找防治方法，进行了细菌的分离鉴定、毒力基因检测、本动物回归攻毒、药物筛选和治疗试验，从而为泥鳅类似疾病的诊断和治疗提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和药物

琼脂营养培养基、氧化酶试纸和细菌微量生化鉴定管、药敏纸片由杭州微生物试剂有限公司生产。PCR kit由北京康为世纪生物科技有限公司生产。DNA胶回收试剂盒由爱思进生物技术（杭州）有限公司生产。3种含碘制剂：优力克，由嘉兴绿望生物科技有限公司生产；迪碘，由成都科宏达科技有限公司生产；蛋氨酸碘，由惠州市三宝生物化学科技有限公司生产。抗菌药物标准品均购自中国兽药监察所。

1.2 临床诊断

对该病例发病前后的养殖管理、水质情况和寄生虫进行临床诊断。

1.3 细菌纯化鉴定和毒力基因检测

3条患病泥鳅（全长16～20 cm）体表消毒后，在超净台内解剖，取肝胰脏截面涂布于营养琼脂表面，接种环划线纯化细菌，28 ℃培养16 h，观察菌落形态。按《弧菌科细菌生化鉴定编码册》，进行革兰氏染色、氧化酶试验和细菌微量生化鉴定。参照朱若林等[8]方法进行16S rDNA扩增、系统进化分析和毒力基因检测。

1.4 注射攻毒试验

将健康泥鳅体长[（8.5±1.1）cm]养在曝气自来水中，水温28～31 ℃，进行注射攻毒试验。取凡隆气单胞菌N-1株为代表，进行注射攻毒回归试验，简化寇氏法计算LD50。设0、105、106、107、108和109 CFU/mL共6个剂量组，10尾/剂量组。试验期间按泥鳅摄食状况少量投饵，不排污。观察14 d，取濒死泥鳅或刚死泥鳅，重新进行细菌分离鉴定。

1.5 外用和内服药物筛选

参考商业检验标准（SN/T 3229—2012）[9]，采用稀释—中和法筛选外用消毒剂。参考欧盟标准[10]，采用纸片法和微量肉汤稀释法进行内服抗菌药物的药敏试验。

1.6 治疗试验

根据“1.5”中筛选出的有效外用和内服药物，进行治疗。

2 结果与分析

2.1 临床诊断

发病池水温28～30 ℃，水质分析各项指标良好。患鳅体表和鳍基部有红色小点，鳍条末梢发白和腐蚀。剖检见患鳅贫血，肝胰腺发白、脆烂如泥、脾脏暗红，未发现寄生虫。

2.2 细菌的纯化鉴定和毒力基因检测

从3尾患鳅肝胰脏分别分离纯化得3株优势菌，并分别命名为N-1、N-2和N-3株。纯化菌在营养琼脂平板上，28 ℃培养16 h后，菌落圆形凸起、乳白色、表面光滑、边缘整齐。3株分离菌均为革兰氏阴性菌，且氧化酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶均为阳性，葡萄糖产酸产气，发酵蔗糖、甘露醇、水杨苷、枸橼酸盐均为阳性，6% NaCl胨水阴性。根据编码鉴定手册可判定3株细菌均疑似为凡隆气单胞菌，但鉴定值仅为57.08%。分子鉴定显示，3株菌的16S rDNA与凡隆气单胞菌的相似性最大，且均大于98%，系统进化树如图1。综上，可确定N-1株、N-2株、N-3株均为凡隆气单胞菌。从凡隆气单胞菌N-2中可检出气溶素aerA、细胞毒性肠毒素Act、热不稳定性肠毒素Alt、丝氨酸蛋白酶Ser这4种毒力基因；凡隆气单胞菌N-1株和N-3株还可检出弹性蛋白酶ahyB（图2）。从基因水平可知，分离株均为致病性气单胞菌。

2.3 本动物注射攻毒试验

试验泥鳅在攻毒后3～7 d相继发病，死亡泥鳅主要表现为皮肤点状出血、鳍条腐蚀等症状。N-1株对试验泥鳅的LD50为2.2×106 CFU/尾。人工感染发病泥鳅肝脏分离菌经检测为攻毒所用菌株。

2.4 有效药物筛选

对市场上比较认可的3种含碘制剂（优力克、迪碘和蛋氨酸碘）进行了非清洁条件和清洁条件下的最小抑菌浓度试验。3种碘制剂效价比以优力克最高，且考虑优力克能促进创伤愈合，后续治疗试验中选择优力克。

纸片法测定的3株菌对14种抗菌药物的敏感性结果如表1所示。微量肉汤稀释法测定的最小抑菌浓度见表2。综上结果，首选国标渔药中的氟苯尼考。

2.5 治疗效果

根据上述结果，采用优力克（浓度为0.25～0.50 mL/m3）全池泼洒，2～3次，每次间隔1 d。氟苯尼考（5 mg/kg体重，相当于10倍的体外最小抑菌浓度）伴饲料内服，连续用7 d，2次/d，治疗效果良好。内服拌料时，添加适量渔用多维、维生素C、清热解毒类和疏肝利胆的中草药，治疗效果更好。

3 討论

在泥鳅养殖过程中，皮肤相关疾病是养殖泥鳅的多发病，一般最开始表现为多发性点状出血病，如不及时治疗会进一步发展为赤皮、腐皮、溃烂、烂鳍等。而引起这些症状的细菌以气单胞菌科成员最为常见[2-4]。 气单胞菌一般被认为是条件致病菌，环境不良、肝胆综合征、应激等均可诱发气单胞菌[6]。该案例中泥鳅有不同程度的肝脏综合征（以贫血、肝胰腺苍白和脆烂为特征），是凡隆气单胞菌继发感染的诱因。此次分离菌均检测出气溶素，其具有溶血活性，可引起出血症状[11]。气溶素的检出，可解释临床所见的出血症状。

凡隆气单胞菌不仅可以感染水生和陆生动物，还可以引起人的腹泻、筋膜溃烂、菌血症、肺炎、脑膜炎[12]。因此，泥鳅的食品安全问题应引起重视。

国内外研究均显示，气单胞菌的耐药性日益严重，因此处理临床病例时，需要进行药敏试验，才能科学用药[13]。在治疗中务必要重视泥鳅的原发病，该研究分离的病原菌毒力并不强，是继发的细菌感染，而原发病是多种原因引起的脂肪肝综合征。该治疗试验也表明，根据药敏试验筛选有针对性的药物，配合保肝清热等中药治疗，疗效良好。

参考文献

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[9] 姜英辉，房保海，祝素珍，等.食品消毒剂和防腐剂杀菌效果评价方法：SNT 3229—2012[S].中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，2012.

[10] 刘玉庆，李璐璐，骆延波，等.EUCAST欧盟药敏试验标准[M].北京：中国标准出版社，2016.

[11] DEGIACOMI M T，IACOVACHE I，PERNOT L，et al.Molecular assembly of the aerolysin pore reveals a swirling membraneinsertion mechanism[J].Nature chemical biology，2013，9（10）：623-629.

[12] BHOWMICK U D，BHATTACHARJEE S.Bacteriological，clinical and virulence aspects of Aeromonasassociated diseases in humans[J].Polish journal of microbiology，2018，67（2）：137-149.

[13] PIOTROWSKA M，POPOWSKA M.The prevalence of antibiotic resistance genes among Aeromonas species in aquatic environments[J].Annals of microbiology，2014，64（3）：921-934.