土壤中产高活性淀粉酶细菌的分离与纯化

文狄 褚丹维 罗绍娇 丁淑金 蒙帮明

摘要 [目的]从土壤中分离纯化产高活性淀粉酶细菌，并研究其产酶条件。[方法]利用淀粉水解圈平板筛选法，从都匀市23份不同地点的土样中分离并筛选到一株产胞外淀粉酶的菌株Z3，其水解圈/菌落直径比达5.50；通过形态学、染色等方法，结合16S rDNA序列的比对鉴定该菌株为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）。并对Z3菌株产酶条件进行了研究。[结果]Z3菌株在1.0%淀粉的碳源、1.0%酵母膏+1.0%牛肉膏的氮源、0.2%的CaCl2·2H2O、30 mL装液量于250 mL摇瓶中的溶氧量，pH为7.0，培养温度为37 ℃的条件下，产酶能力最强。此外，Z3菌株所产淀粉酶的酶学分析显示，其最适酶反应pH为8.0，最适反应温度为39 ℃。[结论]该菌株是产淀粉酶较好的材料，具有一定的应用前景。

关键词 淀粉酶；水解圈；酶活力；产酶条件

中图分类号 S154.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）27-0006-04

Isolation and Purification of Bacteria Producing Highly Active Amylase in Soil

WEN Di，CHU Danwei，LUO Shaojiao et al

（College of Biological Science and Agriculture， Qiannan Normal University for Nationalities， Duyun， Guizhou 558000）

Abstract [Objective]Bacteria producing highly active amylase in soil was isolated and purificated，and enzyme production conditions were studied.[Method]Using starch hydrolysis circle model， a amylaseproducing strain Z3 was screened from 23 soil samples in Duyun. The hydrolysis circle/colony diameter ratio were 5.50； Z3 was identified as Bacillus cereus strain by the morphological observation， staining and 16S rDNA sequences alignment analysis. [Result]The optimum carbon source， nitrogen source， concentration of CaCl2·2H2O， dissolved oxygen， pH and temperature was 1% starch， 1% yeast extract+1% beef extract， 0.2% CaCl2·2H2O， adding 30 mL medium into 250 mL flask， pH 7.0 and 37 ℃respectively. Besides， the enzymatic analysis of Z3 amylase showed that its optimum pH and temperature was 80 and 39 ℃ respectively. [Conclusion]This study showed that Z3 strain was a good amylaseproducing material for the further industrial utilization.

Key words Amylase；Hydrolysis circle；Enzyme activity；Condition of enzyme production

基金項目 国家级“大学生创新创业计划”（201610670040），贵州省教育厅普通高等学校创新团队项目（黔教合人才团队字〔2015〕68），黔南民族师范学院一流培育学科建设项目（2017年生物学学科），贵州省教育厅本科教学工程项目（黔教高发（2015）337号）。

作者简介 文狄（1985-），女，湖南湘乡人，副教授，博士，从事昆虫发育与遗传研究。

收稿日期 2018-05-12；修回日期 2018-05-18

淀粉酶是一类具有生物催化功能并且可以分解淀粉分子的生物酶。淀粉酶广泛存在于动植物体以及各类微生物中，并且淀粉酶种类繁多，实用性强，可应用于日常的工农业生产、废料的处理和微生态制剂等领域[1]。随着科技的进步和生活水平的提高，社会生产对于淀粉酶的需求日益增加，因此在淀粉酶生产的各个过程中，选择适合的能产生高活性淀粉酶的菌株是我们进行淀粉酶生产的关键[2]。该研究从土壤中分离纯化出能产生高活性淀粉酶的菌株，并从不同碳源、氮源、溶氧量、CaCl2·2H2O浓度、温度和pH等方面对其产酶条件进行研究，通过对菌株产生的淀粉酶的酶学条件进行分析和整理，以期获得更经济、实用性更强的高活力淀粉酶[3]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土样采集。

采取校园内绿化草坪、花坛、小树林、实验楼后山、都匀市郊外、菜园、河边等不同生境的土样共23份，量取5～10 cm深土层土壤，置于4 ℃的冰箱保存，作为筛选菌株的材料备用。

1.1.2 培养基。

（1）天然培养基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，琼脂粉15～20 g/L，可溶性淀粉10 g/L，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.2（用1 mol/L盐酸或氢氧化钠调节），121 ℃灭菌30 min。

（2）分离平板培养基：可溶性淀粉4 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl 5 g/L，KH2PO4 1 g/L，琼脂12 g/L，蒸馏水1 000 mL，pH 6.0，121 ℃灭菌30 min。

（3）种子培养基：可溶性淀粉10 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，KH2PO4 2 g/L，水1 000 mL，pH 6.0，121 ℃灭菌30 min。

（4）产酶液体培养基：可溶性淀粉10 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，KH2PO4 2 g/L，CaCl2·2H2O 质量分数为0.05%，MgSO4·7H2O质量分数为0.05%，FeSO4·7H2O质量分数为0.05%，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃灭菌30 min。

（5）碘液：碘 1 g，碘化钾 2 g，加蒸馏水定容至300 mL。

（6）檸檬酸缓冲液，pH 6.0。

1.1.3 试验试剂。

试剂均为市售分析纯生化试剂。

1.1.4 试验仪器。

自动压力蒸汽灭菌器（厦门致微仪器有限公司）；电热恒温干燥箱使用说明书（北京科伟永兴仪器有限公司）；S系列超净工作台（适用：VS-840K、VS-840K-U、VS-13000L、VS-1300L-U、HS-840、 HS-840-U、HS1300、HS-1300-U。北京安泰空气技术有限公司）；ZXDP系列曲线控制恒温培养箱（上海智城分析仪器制造有限公司）；电冰箱（青岛海尔股份有限公司）；HC-2517高速离心机（安徽中科科学仪器有限公司）冰箱。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种筛选。

初筛：称量5 g土样，放入装有45 mL无菌水的三角瓶里，摇床20 min使土样分散均匀，静置5 min后再进行浓度梯度稀释，分别用移液枪量取10-5、10-6、10-7 浓度下的土样稀释液1 mL于灭菌平板上[4-5]，并用玻璃涂布棒涂布均匀，凝固后置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。菌体生长后滴加碘液，若有透明圈出现，表明淀粉被水解，即该菌株能产生胞外淀粉酶。

纯化：挑选有明显水解圈的细菌，在牛肉膏蛋白胨培养基中划线分离，37 ℃培养24 h；重复上述操作，直至产生单菌落。

复筛：将纯化后的菌株转接到试管斜面，37 ℃培养24 h分别再点种到分离培养基上培养，菌体长成后再滴加碘液并比较水解圈大小，挑选水解圈直径（D）与菌落直径（d）比值大于2.5的6株形态较好的菌落作为该试验的出发菌株，并记录二者比值的大小。

1.2.2 淀粉酶活力测定。

发酵液在37 ℃、180 r/min培养24 h，5 000 r/min离心10 min后，取上清液即为粗酶液。

取5 mL 0.5%可溶性淀粉溶液，37 ℃水浴10 min，再加入0.5 mL适当稀释的粗酶液，混匀，37 ℃准确反应10 min后冰浴中终止反应。与碘液作用显色后测定在660 nm波长时的吸光度（A）值。测定结果根据淀粉标准曲线换算成淀粉浓度，以所测定条件下的最高活力为1，其他样品用最高活力校正为相对酶活力[6]。

1.2.3 菌种鉴定。

根据《伯杰细菌鉴定手册》鉴定细胞形态。细菌分子学鉴定利用16S rDNA的序列比对，首先提取细菌总DNA[7]，用16S rDNA通用引物F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和 R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′PCR扩增[3]；PCR扩增条件为95 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循环29次。扩增产物经DNA纯化回收后，送上海生工生物工程股份有限公司测序。将16S rDNA测序结果在NCBI上进行Blast，分析序列相似性，鉴定菌株种类。

1.2.4 不同碳源对菌株产酶的影响。

取出发菌株活化后接入种子培养基中培养24 h，再按1%接种量接种到不同碳源配制的产酶培养基中，37 ℃、180 r/min培养24 h，取粗酶液离心并测酶活，以确定最适碳源。

1.2.5 不同氮源对菌株产酶的影响。

取出发菌株活化后接入种子培养基中培养24 h，再按1%接种量接种种子到不同氮源配制的产酶培养基中，37 ℃、180 r/min培养24 h，取粗酶液离心并测酶活以确定最适氮源[8]。

1.2.6 培养基最适发酵pH的确定。

取出发菌株活化后接入种子培养基中培养24 h，再按1%接种量接种种子到pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和100的产酶培养基中，37 ℃、180 r/min培养24 h，取粗酶液离心并测酶活以确定最适初始pH[8]。

1.2.7 最适培养温度的确定。

取出发菌株活化后接入种子培养基中培养24 h，再按1%接种量接种种子到产酶培养基中，分别在27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47 ℃下培养24 h，取粗酶液离心并测酶活，以确定最适初始pH。

1.2.8 培养基溶氧量对菌株产酶的影响。

取出发菌株活化后接入种子培养基中培养24 h，再按1%接种量接种种子到产酶培养基中，分别装入培养基20、25、30、35、40、45和50 mL于250 mL三角瓶，37 ℃、180 r/min培养24 h，取粗酶液离心并测酶活以确定最适溶氧量[8]。

1.2.9 CaCl2·2H2O浓度对菌株产酶的影响。

向产酶培养基中加入质量浓度依次为0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%的CaCl2·2H2O，37 ℃、180 r/min培养24 h，取粗酶液离心并测酶活以确定最适CaCl2·2H2O浓度。

1.2.10 酶反应最适pH的确定。

用pH为4.0、4.5、5.0、55、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0的柠檬酸缓冲溶液配制可溶性淀粉溶液，取粗酶液离心并在不同pH条件下测酶活，以确定酶反应的最适pH[8]。

1.2.11 酶反应最适温度的确定。

取在已优化条件下培养获得的粗酶液离心，在27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47 ℃不同温度下测酶活，以确定酶反应的最适温度。

2 结果与分析

2.1 产胞外淀粉酶的初筛

从所有土样中共筛选到44株能水解淀粉的细菌，在筛选平板上均能产生明显的水解圈，分别将这44株细菌编号Z1～Z44，并接种到斜面试管培养后低温保存[8]。其中Z3菌株在平板上产生的水解圈如图1所示。

2.2 产胞外淀粉酶的复筛

将所有纯化后的菌种分别点种培养，再向菌落上喷洒碘液，比较水解圈的大小，挑取水解圈直径（D）与菌落直径（d）比值大于2.50的6株菌株（表1）进行3次点种培养，选择直径比最大的Z3菌株作为出发菌株[9]。菌株在平板上产生的水解圈如图1所示。

2.3 Z3菌株的鉴定

2.3.1 Z3菌株的形态学鉴定。Z3菌株革兰氏阳性，细胞呈杆状，无荚膜，有明显的芽孢（图2、3）。

2.3.2 Z3菌株的分子学鉴定。

16S rDNA 序列是细菌鉴定的重要指标，利用PCR扩增Z3菌株的16S rDNA序列，并用NCBI的Blast进行核苷酸同源性比对，结果表明Z3菌株为蜡状芽胞杆菌（Bacillus cereus）。

2.4 液体发酵培养基的优化

为优化发酵条件，对Z3菌株的发酵培养基碳源、氮源的種类、发酵培养基的初始pH、发酵温度、溶氧量和Ca2+进行考察，以确定Z3菌株的最佳产酶条件。

2.4.1 碳源对Z3菌株产酶的影响。

以1%蛋白胨为氮源，用不同碳源配制产酶液体培养基培养菌株Z3，37 ℃、180 r/min培养24 h，取粗酶液离心并测酶活。结果如图4所示，以质量分数为1%的可溶性淀粉作为碳源时，Z3菌株酶活力最高，定义为1，相对酶活从高到低，依次是1%麦芽糖、1%乳糖、1%蔗糖、1%葡萄糖，相对酶活分别为0.84、0.81、078、076。

2.4.2 氮源对Z3菌株产酶的影响。

以1%可溶性淀粉为碳源，用不同氮源配制产酶液体培养基培养菌株Z3，37 ℃、180 r/min培养24 h，取粗酶液离心并测酶活[9]。结果如图5所示，以1%酵母膏+1%牛肉膏作为氮源时菌株Z3酶活力最高。

2.4.3 溶氧量对Z3菌株产酶的影响。

在不同的溶氧条件下培养Z3菌株，37 ℃、180 r/min培养24 h，取粗酶液离心并测定不同溶氧条件下的酶活。结果如图6所示，250 mL摇瓶中装液量为30 mL时为最佳溶氧量，其后依次为装液量为50、40、45、35、25、20 mL。整体趋势为随着装液量的增加，单位体积的粗酶液相对酶活力逐渐增大，当装液量达到30 mL/250 mL时酶活力达到峰值，然后稍有下降，并趋于平稳。

2.4.4 CaCl2·2H2O浓度对Z3菌株产酶的影响。

向产酶培养基中加入不同质量浓度的CaCl2·2H2O，对Z3菌株进行发酵产酶试验，然后进行粗酶液酶活测定。结果图7所示，随着CaCl2·2H2O浓度的增加，Z3菌株产酶相对活力逐渐升高，到达峰值之后，稍有下降，其后趋于稳定，其中当CaCl2·2H2O浓度为0.2%时，单位体积粗酶液相对酶活最高，其后依次是0.6%、0.4%、1.0%、0.8%、0%，其相对酶活分别为087、0.82、0.81、0.77、0.61。

2.4.5 培养基初始pH对Z3菌株产酶的影响。

将已优化的产酶培养基pH设置为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，接种Z3菌株，37 ℃、180 r/min培养24 h，测定以上pH情况下Z3菌株产淀粉酶的相对酶活力，结果如图8所示。当pH范围从4.0逐渐增大到7.0时，Z3菌株粗酶液相对酶活力逐渐增加；当pH达到7.0时，相对酶活力达到峰值；当pH继续增加，从7.0到10.0时，Z3菌株粗酶液相对酶活力逐渐降低。以上数据表明，Z3菌株发酵最佳pH为7.0，呈中性。

2.4.6 培养温度对Z3菌株产酶的影响。

将Z3菌株置于27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47 ℃温度下培养，180 r/min培养24 h，测定不同温度培养条件下Z3菌株粗酶液的酶活力，结果如图9所示。当温度从27 ℃上升到37 ℃时，Z3菌株粗酶液的相对酶活力逐渐增强；培养温度在37 ℃，Z3菌株粗酶液的相对酶活力最高。当温度从37 ℃继续上升到47 ℃时，Z3菌株粗酶液的相对酶活力逐渐减小；试验数据表明，Z3菌株发酵最适温度为37 ℃。

2.5 Z3菌株所产淀粉酶的酶学性质

2.5.1 酶反应的最适pH。

将Z3菌株在产酶培养基中，37 ℃，180 r/min培养24 h，再用pH为4.0、4.5、5.0、5.5、60、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的柠檬酸缓冲液配制可溶性淀粉溶液，取粗酶液离心并测相对酶活。结果如图10所示，当酶反应的pH在4.0到8.0范围内，随pH的升高，相对酶活力逐渐增强；在pH为8.0时，Z3菌株淀粉酶相对酶活力达到峰值；当酶反应的pH在8.0～10.0范围内，随pH的继续上升，相对酶活力逐渐减弱；以上数据表明，Z3菌株所产淀粉酶为偏碱性淀粉酶。

2.5.2 酶反应的最适温度。

将Z3菌株在37 ℃、180 r/min培养24 h，分别在27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47 ℃不同温度下测菌株Z3所产胞外淀粉酶的相对酶活力。结果如图11所示，在27～39 ℃时，随反应温度的升高，相对酶活逐渐增强；当反应温度在39 ℃时，相对酶活最高；在39～47 ℃时，随反应温度的升高，相对酶活力逐渐减弱。数据表明，Z3所产胞外淀粉酶最佳反应温度为39 ℃。

3 结论与讨论

该研究通过淀粉水解圈平板筛选法，从都匀市不同地点采集到23份土样中，分离到44株产胞外淀粉酶的细菌，并通过复筛从6株水解圈/菌落直径比相对较大的菌株中筛选得到一株产淀粉酶活力较高的菌株Z3，其水解圈/菌落直径比达5.5。通过检测相对酶活力，对Z3菌株产酶条件进行研究，结果显示：培养基Z3菌株产酶最适碳源为1.0%淀粉；氮源

为1.0%酵母膏+1.0%牛肉膏；最適溶氧量为250 mL摇瓶装30 mL培养基；最适CaCl2·2H2O浓度为0.2%的CaCl2·2H2O；最佳培养基pH为7.0；培养最佳温度为37 ℃。此外，该研究还对菌株Z3所产淀粉酶的酶学性质进行初步研究，数据显示其最适酶反应pH为8.0，但在pH 10.0的强碱性环境仍具有相对较高的酶活；其最适酶反应温度为39 ℃，且在27～47 ℃的较宽温度条件下均具有一定酶活，表明Z3菌株

所产淀粉酶为偏碱性且适温性较广，可以作为工业生产进一步开发利用。

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