鹅源巴氏杆菌的分离与鉴定

胡晓苗，张丹俊，戴银，赵瑞宏，潘孝成，周学利，侯宏艳，沈学怀，朱传明

摘要 [目的]鉴定引起病死鹅肝脏表面出现大量针尖大、白色坏死点的致病菌。[方法]取肝涂片镜检，然后进行瑞氏-吉姆萨染色。用普通肉汤培养基和鲜血培养基进行分离和纯化，然后用巴氏杆菌特异性引物进行PCR扩增，将扩增产物克隆至PMD18-T载体上，送至生物公司进行测序。[结果]序列同源性分析表明，分离菌与多杀性禽巴氏杆菌的相似性为99%，结合生化试验结果确定其为多杀性巴氏杆菌。[结论]研究可为鹅巴氏杆菌病的防治提供依据。

关键词 多杀性巴氏杆菌；分离；鉴定

中图分类号 S852.61+2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）06-0069-02

Isolation and Identification of Pasteurella multocida in Goose

HU Xiaomiao， ZHANG Danjun， DAI Yin et al （Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230031）

Abstract [Objective]To identify the pathogen that caused a large number of white necrosis of the needle point in the liver surface of dead geese.[Method]The microscopic examination of liver smear was observed， and WrightGiemsa staining was conducted.After using ordinary broth and blood culture medium for separation and purification， PCR amplification was carried out by Pasteurella multocida specific primers .The purified product was cloned into PMD18T vector ， then sent to the biological company for sequencing. [Result]The similarity of the obtained sequencing result by comparison to Pasteurella multocida was 99%， which was determined as Pasteurella multocida combined with biochemical test results.[Conclusion]The research could provide basis for the prevention and control of pasteurellosis.

Key words Pasteurella multocida；Isolation；Identification

鹅巴氏杆菌病又称鹅霍乱，是由多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）引起的一种高度接触性、败血性传染病。该病发病急、死亡快，其发病率和死亡率由于饲养管理、病原毒力等不同而存在差异。据不完全统计，发病率高达35%，死亡率高达70%，如果出现混合感染，死亡率可能更高，严重威胁着我国养鹅业的健康发展。笔者取疑似感染巴氏杆菌病的病死鹅肝脏作为接种物，接种在普通肉汤培养基和鲜血培养基上进行细菌分离和纯化，通过生化试验鉴定挑选出生化反应相符的菌株进行保存备用。根据GenBank已发布的多杀性巴氏杆菌的16S RNA基因和OmpA基因设计2对引物[1-3]，通过PCR检测鉴定是否为致病性巴氏杆菌。

1 材料与方法

1.1 病料 病料来源于安徽省农业科学院畜牧兽医研究所兽医临床诊断中心送检的鹅肝脏。

1.2 培养基与主要试剂 普通肉汤培养基、鲜血培养基由实验室自配；琼脂糖、Taq Master Mix、DNA Marker 2000，均购自上海生工生物工程技术有限公司。

1.3 细菌的分离与纯化 取疑似巴氏杆菌鹅的肝脏接种于普通肉汤培养基进行增菌培养，然后挑取增菌液置于鲜血培养基上，置于37 ℃恒温培养箱内培养24 h。挑取其中特征性可疑的菌落进行二次培养，反复纯化2次，得到其纯培养置于4 ℃冰箱内保存备用。

1.4 染色镜检 从鲜血培养基上挑取1株纯化后的疑似菌落进行涂片，进行瑞氏染色镜检，并观察其染色特性和形态。

1.5 引物的合成 根据GenBank已发布的巴氏杆菌的16S RNA和OmpA基因设计2对引物（表1），引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。利用设计的2对引物，对菌株进行PCR检测。

1.6 PCR检测鹅致病性巴氏杆菌16S RNA基因 PCR反应体系如下：菌液模板1 μL，Taq Master Mix 10 μL，上、下引物各1 μL，无菌ddH2O补足20 μL。PCR反应程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；最后72 ℃延伸8 min。利用1.3%琼脂糖凝胶电泳进行观察，拍照并记录电泳结果。

1.7 PCR检测鹅致病性巴氏杆菌OmpA基因 PCR反应体系如下：DNA模板1 μL，Taq Master Mix 10 μL，上、下引物各2 μL，无菌ddH2O补足20 μL。PCR反应程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循环；最后72 ℃延伸10 min。利用1.3%琼脂糖凝胶电泳进行观察，拍照并记录电泳结果。

1.8 PCR产物的纯化、克隆与序列分析 对16S RNA基因和OmpA基因的PCR产物按照DNA回收试剂盒说明书进行回收目的片段。然后，进行T载体连接，10 μL体系包括PMD18-T 0.5 μL、目的基因4.5 μL，solution I 5 μL，16 ℃水浴30 min。最后，转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞内，并涂布在含抗生素氨苄的培养基上置于37 ℃恒温培养箱内培养过夜，取经PCR检测出目的条带的菌落进行测序。测序工作由合肥安博森生物科技有限公司完成，对测序基因序列进行同源性分析。

2 结果与分析

2.1 病理剖检 病鹅剖检呈典型败血性变化，肝脏表面出现大量针尖大的白色坏死点（图1）。

2.2 细菌分离与鉴定 接种于鲜血培养基上，呈现出半透明的灰白色、露珠样、微微隆起且表面光滑、边缘整齐的小菌落[2]。从鲜血培养基上挑取其中单一的典型菌落进行瑞士染色，通过镜检可见两极着色的短杆菌。

2.3 对巴氏杆菌进行16S RNA基因和OmpA基因检测 16S RNA基因和OmpA基因的PCR扩增产物大小分别为862和201 bp，与目的片段大小一致，检测结果如图2所示。

2.4 同源性分析 对16S RNA基因序列进行Blast对比，其与多杀性巴氏杆菌CP019081.1、CP007205.1、CP004392.1的同源性最高，达到99%。对OmpA基因序列进行Blast對比，其与多杀性巴氏杆菌CP020403.1、CP019081.1、KX161895.1的同源性最高，达到99%。因此，可确定分离菌为多杀性巴氏杆菌。

2.5 生化试验结果 对病料中分离出的细菌按照常规方法进行了生化鉴定，结果见表2。

3 讨论

此鉴定方法应用于葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、禽流感等时均不能扩增出目的片段.却可从禽多杀性巴氏杆菌扩增出862和201 bp大小的特异性片段[4-6]，表明引物只对禽多杀性巴氏杆菌有特异性，敏感性强，基本不会出现杂菌干扰。生化鉴定是进行细菌鉴定分型的标准方法，但该方法所需要的时间过长，操作也相对繁琐，且所需要的仪器较多，耗费大量的人力和物力。应用PCR检测技术不仅可对纯培养物进行检测，又可直接从病料的初次培养物中进行检测，不必进行纯化培养，还可从病料组织中直接提取DNA，操作简单，大大缩短检测所需时间，能达到准确、快速诊断的目的，对于及早采取有效的防治措施具有重要的实践意义[7-9]。

参考文献

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