液相色谱—串联质谱法快速检测猪肉中25种β—受体激动剂

胡佳哲 梁贤凯 赖宇红

摘要 [目的]建立液相色谱-串联质谱法快速同时测定猪肉中克伦特罗、西马特罗、溴代克伦特罗、马布特罗、羟甲基克伦特罗、溴布特罗、福莫特罗、马贲特罗、苯氧丙酚胺、拉贝特罗、氯丙那林、沙丁胺醇、苯乙醇胺A、妥布特罗、特布他林、莱克多巴胺、菲诺特罗、克伦塞罗、齐帕特罗、克伦潘特、克伦特罗、西布特罗、班布特罗、丙卡特罗、沙美特罗25种β-受体激动剂的分析方法。[方法]样品经0.2 mol/L磷酸-甲醇（1∶1）提取，Bond ElutPlexa PCX小柱净化，Thermo Accucore Phenyl Hexyl（2.6 μm，100 mm×2.1 mm）色谱柱分离，电喷雾正离子模式测定，内标法定量。[结果]25种β-受体激动剂在2.5～100.0 μg/L呈良好线性关系，决定系数R.2均大于0.990，在猪肉中的检出限为0.2～1.2 μg/kg，在2.5、5.0和10.0 μg/kg 3个加标水平下的回收率为83.70%～112.20%，RSD为0.18%～10.10%。[结论]该方法前处理简单、灵敏度高、适用性好，可用于批量猪肉中25种β-受体激动剂的快速确证分析。

关键词 液相色谱-串联质谱；β-受体激动剂；快速检测；猪肉

中图分类号 S851.34.+7 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）23-0155-06

Abstract [Objective] The research aimed to establish a method of rapid simultaneous determination of clenbutero，cimaterol，bromchlorbuterol，mabuterol，hydroxymethylclenbuterol，brombiterol，formoterol，mapenterol，tsoxsuprine，labeiterol，clorprenaline，salbutamol，phenylethanolamineA，tulobuterol，terbutalin，ractopamine，fenoterol，clencyclohexerol，zilpaterol，clenpenterol，clenbuterol，cimbuterol，bambuterol，procaterol，salmeterol twentyfive kinds of beta receptor agonists by liquid chromatographytandem mass spectrometry.[Method]The sample was extracted by 0.2 mol/L phosphatemethanol （1：1），and the extracts were purified by Bond Elut Plexa PCX，after being eluted from the cleanup column，the analytes were separated on a Thermo Accucore Phenyl Hexyl （2.6 m，100 mm x 2.1mm） column and detected by electrospray mass spectrometry in positive ionization mode with multiple reaction monitoring.The method was quantitatively detected by internal standard method.[Result]The linear ranges of twentyfive kinds of betareceptor agonist were in the range of 2.5-100.0 μg/L with correlation coefficients higher than 0.990.The limits of detection（LOD） were 0.2-1.2 μg/kg.The recoveries of 2.5，5.0 and 10.0 μg/kg was 83.70%-112.20%，and the relative standard deviation （RSD） was 0.18-10.10%.[Conclusion] This method is simple，sensitive and applicable，and can be used for the rapid confirmation analysis of twentyfive kinds of betareceptor agonist in pork.

Key words Liquid chromatographytandem mass spectrometry；Betareceptor agonist；Rapid detection；Pork

β-受體激动剂，俗称瘦肉精，是具有苯乙醇胺结构的肾上腺素类合成药物[1]。在临床上，β-受体激动剂可以放松支气管平滑肌，增加纤毛运动频率，调节黏膜纤毛的清除率，可以用于治疗支气管炎和哮喘等疾病[2-3]。这类药物结构中的活性基团，在动物体内能结合组织细胞膜中的β-受体，从而发生一系列生理效应，可以促使平滑肌扩张，增加肺活量，同时干扰胰岛素的释放，加快体内糖原和脂肪的分解[4]。在动物饲养过程使用这类药物，可提高饲料的转化率，达到营养再分配的作用，进而明显提高动物的瘦肉率[5]。β-受体激动剂类药物有较强的蛋白质同化作用，残留的瘦肉精通过食物链会被人体吸收进而造成人体中毒。人食用有瘦肉精残留的食物后，会出现肌肉振颤、心慌、战栗、头疼、恶心、呕吐等症状[6]，对于患有高血压、心脏病、甲亢和前列腺肥大等疾病的人影响和危害更大，严重者可危及生命[7]。

目前，关于β-受体激动剂类药物残留检测方法大多采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS）[8-17]，多数选择酶解、酸化水溶液提取、碱化有机溶剂提取、阳离子交换固相萃取净化，步骤操作繁琐，费时，干扰因素多。针对我国消费量较大的猪肉，构建前处理快速简便、能同时测定20余种β-受体激动剂的LC-MS检测方法，以有效控制动物源性食品中该类药物的残留量具有十分重要的现实意义。笔者采用酸化提取并通过Bond Elut Plexa PCX固相萃取净化的预处理，液相色谱-串联质谱技术进行分离检测，快速测定和分析猪肉中25种β-受体激动剂。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器。LC-20ADXR/四元梯度泵高效液相色谱（日本Shimadzu 公司）；TripleQuad5500三重四极杆质谱检测系统（美国AB SCIEX 公司）；Thermo X1R低温高速离心机（美国Thermo公司）；多功能涡旋混合器（Talbous公司）；HY-2A调速多功能振荡器（江苏常州澳华仪器有限公司）；Labtech MV5自动氮吹仪（LabTech公司）；KQ-500DE超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q 超纯水仪（美国Millipore 公司）。

1.1.2 主要试剂。克伦特罗、西马特罗、溴代克伦特罗、马布特罗、羟甲基克伦特罗、溴布特罗、富麻酸福莫特罗、马贲特罗、苯氧丙酚胺、拉贝特罗、氯丙那林、沙丁胺醇、苯乙醇胺A、托布特罗、特布他林、莱克多巴胺、菲诺特罗、克伦塞罗、齐帕特罗、克伦潘特、克伦特罗、西布特罗、班布特罗、丙卡特罗、沙美特罗、沙丁胺醇-D3、克伦特罗D9标准品，购自德国Dr.Ehrensorfer公司；均质子、Bond Elut Plexa PCX小柱（200 mg，6 mL），均购自美国Aligent公司；甲醇、乙腈试剂，均产自美国Merck公司，均为色谱纯；甲酸试剂，产自美国Fluka公司，色谱纯；其他未作特殊说明的试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 对照品溶液的制备。

1.2.1.1 25种β-受体激动剂储备溶液。准确称取各标准品10.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶，配制成1.0 mg/mL的单标标准储备溶液，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.1.2 25种β-受体激动剂混合标准工作液。分别移取适量的单标储备液，用甲醇逐级稀释成浓度为1.0 mg/L的25种β-受体激动剂混合标准工作液，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.1.3 内标储备溶液。准确称取沙丁胺醇-D3和克伦特罗-D9各10.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶，配制成1.0 mg/mL的单标标准储备溶液，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.1.4 内标混合标准工作液。分别移取适量的内标单标储备液，用甲醇逐级稀释成浓度为50 ng/mL的内标混合标准工作液，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 供试品溶液的制备。称取2.0 g均質样品于50 mL离心管中，加入100 μL混合内标工作液（浓度为50 ng/mL），涡旋混匀，加入一枚均质子和0.2 mol/L磷酸-甲醇（1∶1）10 mL，水平振荡20 min，在4 ℃、10 000 r/min离心5 min。将上清液转移至另一离心管中，残渣用0.2 mol/L磷酸10 mL再提取1次，合并2次上清液，在4 ℃、10 000 r/min离心5 min，取上清液备用净化。

Bond Elut Plexa PCX小柱（200 mg，6 mL），依次用5 mL甲醇和5 mL水活化，将上述待净化液加入小柱中，待流干，依次用5 mL水和5 mL甲醇淋洗，弃掉，用5 mL 5%氨水甲醇洗脱，收集流出液。将流出液在50 ℃下氮气吹至近干，用2 mL 0.1%甲酸-甲醇（9∶1）复溶，充分溶解，过0.22 μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.2.3 仪器分析条件。

1.2.3.1 液相色谱条件。色谱柱为Thermo Accucore Phenyl Hexyl（2.6 μm，100 mm×2.1 mm）；流速为0.3 mL/min；柱温为40 ℃；流动相A为0.1%甲酸水（含5 mmol/L乙酸胺），流动相B为0.1%甲酸乙腈。洗脱梯度：0～1.0，5%B；1.0～3.5，5%～35%B；3.5～6.0，35%～80%B；6.0～8.0，80%B；8.0～8.1，80%～5%B；8.1～10.0，5%B。

1.2.3.2 质谱条件。电喷雾离子源（ESI），多反应监测（MRM），正离子模式；喷雾电压5.5 kV；气帘气压力0.24 MPa；碰撞气压力0.02 MPa；温度500 ℃；碰撞室入口电压10 V；碰撞室出口电压12 V；驻留时间50 ms；离子源Gas1和Gas2均为0.50 MPa。其他参数见表1。

1.2.4 方法学考察。

1.2.4.1 标准曲线的绘制。将25种β-受体激动剂混合标准溶液按比例配制为2.5、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL（内标物浓度均为2.5 ng/mL）6个浓度，按照“1.2.3”仪器分析条件测定，每次进样10 μL，以对照品浓度（ng/mL）为横坐标、外标峰面积与内标峰面积比值R为纵坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程。

1.2.4.2 检出限的考察。将25种β-受体激动剂混合标准溶液逐步稀释后进样测定，以色谱图中信噪比（S/N）为3时的进样量为最低检测限（LOD）。

1.2.4.3 加样回收试验和精密度试验。选择阴性猪肉样品，精密添加适当的25种β-受体激动剂混合标准溶液，考察低（2.5 μg/kg）、中（5.0 μg/kg）、高（10.0 μg/kg）3个浓度水平的回收试验，混合均匀后，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，再按“1.2.3”仪器分析条件测定，进样量为10 μL，每个加标水平平行测定6次，测定外标峰面积与内标峰面积比值R，计算平均回收率和精密度（RSD）。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化 质谱优化采用微量进样泵连续进样的方式，分别对浓度为50 ng/mL的克伦特罗、西马特罗、溴代克伦特罗、马布特罗、羟甲基克伦特罗、溴布特罗、富麻酸福莫特罗、马贲特罗、苯氧丙酚胺、拉贝特罗、氯丙那林、沙丁胺醇、苯乙醇胺A、妥布特罗、特布他林、莱克多巴胺、菲诺特罗、克伦塞罗、齐帕特罗、克伦潘特、克伦特罗、西布特罗、班布特罗、丙卡特罗和沙美特罗的标准溶液进行一级质谱扫描，确定各个组分准分子离子，优化喷雾电压、离子源温度、脱溶剂温度、气帘气、雾化气、辅助加热气条件，使25种β-受体激动剂母离子综合响应强度达到最佳。将获得的母离子进行二级质谱扫描，分别优化25种β-受体激动剂的碎片离子，对去簇电压、碰撞能量、碰撞室射出电压进行优化，选择丰度较高的2个碎片离子作为定量和定性离子。

2.2 色谱条件的优化 大多数β-受体激动剂类的色谱分离采用0.1%甲酸溶液和甲醇或乙腈组成的混合溶液作为流动相，试验用0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸水作为流动相时，发现菲诺特罗、苯乙醇胺A、丙卡特罗、沙美特罗的离子化程度不好，在水系流动相中添加少许乙酸铵，上述情况得到明显改善，保证测定灵敏度的同时，化合物之间的分离度也得到进一步改善。试验比较了0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L乙酸胺）和0.1%甲酸水溶液（含10 mmol/L乙酸胺）作为流动相，发现分离度与回收率并没有随着乙酸胺浓度升高而增高，因此最终选择0.1%甲酸水（含5 mmol/L乙酸胺）和0.1%甲酸乙腈作为流动相。

2.3 提取溶剂的选择 水解主要包括酸解和酶解，酶制剂本身及其水解的样品往往可产生大量的干扰物质，且酶解条件受酶种类、样品基质及水解条件不同而有所不同，而酸解的分析结果与酶解相近，且产生的干扰物质较少，该研究采用酸解的方式进行水解。结合25种β-受体激动剂不同的极性，最后确定0.2 mol/L磷酸与甲醇同比例混合溶液进行水解提取。

2.4 固相萃取柱的选择 由于动物源性食品中的基质成分复杂，即使经过0.2 mmol/L磷酸-甲醇（1∶1）提取后，提取液中含有很多杂质干扰目标物在仪器上的响应。所以该试验采用固相萃取小柱对提取液进一步的净化和富集，并比较了常用的中性氧化铝小柱、HLB小柱、硅胶小柱和PCX小柱等4种固相萃取小柱对25种β-受体激动剂的净化效果，以25种待测物的平均加标回收率作为比较依据。结果发现，相比较其他几款小柱，PCX小柱对样品提取液的净化效果好，加标回收率最高。主要是因为在酸性条件下，PCX小柱能够吸附具有一定弱碱性的β-受体激动剂，淋洗液淋洗杂质后，再用碱性有机溶剂进行洗脱，洗脱液较为干净，杂质少，能对提取液起到很好的净化效果。

2.5 方法學考察

2.5.1 线性关系和检出限的考察。按“1.2.4.1”和“1.2.4.2”方法操作，以β-受体激动剂的浓度为横坐标、相应组分的峰面积与内标物峰面积的比值为纵坐标，进行内标法校正，25种β-受体激动剂的线性结果见表2，决定系数R.2均大于0.990。以特征离子信噪比S/N>3对应的浓度为检出限，各待测物的检出限为0.2～1.2 ng/mL，方法的灵敏度完全满足国家标准对β-受体激动剂的限量检测要求。

2.5.2 回收试验和精密度的考察。按“1.2.4.3”方法操作，计算平均回收率和精密度（表3），色谱图如图1～3所示。从表3可看出，25种待测物的回收率为83.70%～112.20%，相对标准偏差（RSD）为0.18%～10.10%。表明该方法准确、可靠，精密度良好，可用于猪肉等动物源性食品中多种β-受体激动剂残留的检测。

3 结论

该研究建立了猪肉中25种β-受体激动剂的固相萃取净化/液相色谱-质谱的快速检测方法。试验优化了色谱条件和质谱参数，优选出0.2 mol/L磷酸与甲醇同比例混合溶液提取和Bond Elut Plexa PCX净化体系。方法学评价结果表明，25种β-受体激动剂在2.5～100.0 ng/mL呈良好线性关系，决定系数R.2均大于0.990，在猪肉中的检出限为0.2～1.2 μg/kg。通过添加2.5、5.0和10.0 μg/kg的3个浓度水平回收试验，发现25种β-受体激动剂的回收率为83.70%～112.20%，RSD为0.18%～10.10%。该方法前处理简单、灵敏度高、适用性好，适用于大批量样品的快速筛选和定量测定，为快速监测猪肉乃至动物源性食品中禁用β-受体激动剂类物质的残留情况，提高监管和产品质量提供技术支持。

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