大西洋鳕鱼皮多肽体外抗氧化活性研究

阎洁 沈楚仪 李彤

摘要 [目的]探讨大西洋鳕鱼皮多肽的体外抗氧化活性。[方法]选择胰蛋白酶酶解鳕鱼皮，分别以氨基氮滴定法和DPPH自由基清除率作为筛选指标，通过正交试验，筛选出酶解的最优条件；将超滤液分成5段，分别进行DPPH自由基清除率、ABTS自由基力及亚铁离子螯合能力的体外抗氧化活性。[结果]胰蛋白酶酶解大西洋鳕鱼皮的最优条件为料液比1∶1，加酶量2 500 U/g、酶解时间4 h、温度45 ℃、pH 9.0。当分子量小于5 kD时，DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和Fe.2+离子螯合能力最强。[结论]经胰蛋白酶酶解，获得的大西洋鳕鱼皮多肽存在较好的抗氧化活性。

关键词 鳕鱼皮；多肽；胰蛋白酶；抗氧化

中图分类号 TS254 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）23-0144-04

Abstract [Objective] The research aimed to discuss the antioxidant activity of Atlantic codfish skin polypeptides in vitro.[Method]The enzymatic codfish skin was selected by trypsin， amino nitrogen titration method and DPPH free radical scavenging rate were used as screening indicators. The optimum conditions for enzymolysis were screened by orthogonal test.The ultrafiltrate was divided into 5 segments and the antioxidant activities in vitro of DPPH free radical scavenging rate， ABTS free radical force and ferrous ion chelating ability were performed.[Result]The optimal conditions for trypsin enzymatic hydrolysis of Atlantic codfish skin were： solid-liquid ratio 1∶1， enzyme dosage 2 500 U/g， hydrolysis time 4 h， temperature 45 ℃， and pH 9.When the molecular weight was less than 5 kD， DPPH radical scavenging ability， ABTS radical scavenging ability， and Fe.2+ ion chelating ability were the strongest.[Conclusion]After trypsin digestion， the obtained Atlantic codfish skin polypeptides has better antioxidant activity.

Key words Codfish skin；Polypeptides；Trypsin；Antioxidant

鱈鱼是全球年捕捞量最大的鱼类之一，有重要的食用和经济价值，主要分为大西洋鳕鱼、格陵兰鳕鱼和太平洋鳕鱼。在我国，鳕鱼主要分布于黄海和东海北部，鳕鱼皮中富含的蛋白质最高可达总量的80%以上，若能对其充分利用，不但可以提高鱼类加工的附加值，而且可以减少海洋资源的浪费以及环境的污染，获得良好的经济效益与社会效益，对促进鱼类产品加工业的发展具有重要意义[1-2]。目前鱼类胶原蛋白在工业生产中所占的比例较小，相比于牛、猪等陆生动物的胶原蛋白，鱼类胶原蛋白更容易酶解，且抗原性和过敏性也较低，这些理化性质比陆生动物胶原蛋白更具有明显的优势。我国鳕鱼皮资源丰富，而国内外对鳕鱼皮的关注度不高，对鳕鱼皮胶原蛋白肽的功能特性和抗氧化活性的研究比较少。鳕鱼皮为加工副产品，约占加工量的7%～8%。鱼皮中的干物质有50%以上为胶原蛋白，因此鳕鱼皮可作为一种新型的、富有优势的胶原蛋白资源[3-6]。该试验旨在研究大西洋鳕鱼皮蛋白多肽的功能特性和抗氧化活性，为其在食品、化妆品等相关领域的开发和应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大西洋鳕鱼皮购自舟山市水产品企业；胰蛋白酶购于北京亚太恒信生物有限公司；DPPH、乙醇、邻二氮菲、硫酸亚铁、H2O2、ABTS、氯化亚铁、EDTA均购自国药

集团化学试剂有限公司。

1.2 试验仪器 U2800紫外分光光度计，上海光谱仪器公司；CR21G低温高速离心机，日本日立公司；HWS12电热恒温水浴锅，上海一恒仪器有限公司；Cogent u Scale超滤系统，美国密理博公司；DS-1高速组织搅拌机，上海标本模型厂。

1.3 试验方法

1.3.1 鳕鱼皮的预处理。

将干大西洋鳕鱼皮清水浸泡2 h，去鱼鳞、去碎肉后清洗干净，剪碎成3 cm×3 cm的小方块，用20倍鱼皮质量的0.1 mol/L的NaOH浸泡鱼皮以脱去杂蛋白，浸泡12 h后，反复冲洗至中性，沥干，组织搅拌机15 000 r/min搅碎15 min匀浆至糊状。处理后的样品于低温储存备用。

1.3.2 酶解液的制备。

将匀浆好的鳕鱼皮取10 g，调解料液比，按照设定的条件加入适量的胰蛋白酶进行酶解。酶解结束在100 ℃水浴下灭活10 min，冷却至室温后，在低温高速离心机中以9 000 r/min的转速离心10 min，收上清液备用。

1.3.3 酶解工艺优化。

筛选工艺的标准是分别以游离氨基氮含量和DPPH自由基清除率，考察料液比（A）、加酶量（B）、酶解时间（C）、酶解温度（D）、E（pH）这5个因素对胰蛋白酶酶解制备鳕鱼皮的抗氧化肽产生的影响。通过设计正交试验确定大西洋鳕鱼皮抗氧化肽提取的最佳工艺条件。L16（4.5）正交试验设计因素和水平见表1。

1.3.3.1 电位滴定法测定游离氨基氮。

根据文献[7]进行游离氨基氮的测量。取10 mL的酶解液置于烧杯中，加60 mL的蒸馏水，磁力搅拌后用0.05 mol/L NaOH溶液滴定至pH为82，加入10 mL的甲醛混合均匀，再次用相同浓度的NaOH溶液继续滴定至pH=9.2（记下消耗NaOH标准的毫升数V1），同时取70 mL的蒸馏水做试剂空白试验（V2）。按下列公式计算游离氨基氮含量，游离氨基氮含量与水解度呈正相关。

1.3.3.2 DPPH自由基清除能力。

根据文献[8]

进行DPPH的测量。0.3 mL样品和2.7 mL质量浓度为0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液混合并剧烈振荡2 min，再将其放置于黑暗中1 h，于517 nm处测吸光度。以As为阳性对照。DPPH自由基清除率按以下公式计算：

1.3.4 酶解液的超滤与分离。

将大批量最优条件下的灭活、离心后的酶解液进行抽滤。除去酶解液中所含的固体杂质，使固液分离。然后将酶解液的粗提液进行超滤分段，分别过30、10、8、5 kD膜，将得到5个组分，依次为>30 kD（MD-Ⅰ）、>10～30 kD（MD-Ⅱ）、>8～10 kD（MD-Ⅲ）、>5～8 kD（MD-Ⅳ）、≤5 kD（MD-Ⅴ）。分别称量15.0、10.0、5.0、2.5、1.0 mg/mL的MD-Ⅰ、MD-Ⅱ、MD-Ⅲ、MD-Ⅳ、MD-Ⅴ和MD粗体物进行DPPH清除能力的测定，ABTS自由基清除试验及亚铁离子螯合能力测定。

1.3.5 抗氧化活性分析。

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力。

不同浓度的样品多肽对DPPH自由基的清除能力测定参照“1.3.3.2”方法。

1.3.5.2 ABTS自由基清除能力。

首先将ABTS溶于过硫酸钾溶液（2.45 mmol/L）中使浓度达到7 mmol/L，在暗室静放16 h后，用PBS缓冲溶液稀释，当吸光度在734 nm下检测值为0.70±0.02，该值为Ac。1 mL ABTS稀释液与1 mL样品充分混合，10 min后在734 nm紫外光下检测，检测值为As。按下列公式计算ABTS自由基的清除率：

ABTS自由基清除率=（Ac-As）/Ac×100%（3）

1.3.5.3 Fe.2+螯合能力测定。将100 μL不同浓度的样品溶液加入微量离心管中，依次加入135 μL的去离子水和5 μL2 mmol/L的氯化亚铁溶液，充分混匀，3 min后加入10 μL 5 mmol/L的菲咯嗪，剧烈振荡后，在室温下静置10 min。

反应后的溶液在562 nm处测其吸光度As。以去离子水作为空白对照测其吸光度Ac，EDTA代替样品作为阳性对照。抗氧化肽与EDTA的Fe.2+螯合能力计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 最佳酶解工艺的确定

2.1.1 以游离氨基氮含量为指标。

以游离氨基氮含量为指标，采用L16（4.5）正交试验确定鳕鱼皮多肽胰蛋白酶解的最佳条件见表2。对表2正交试验结果进行极差分析，结果显示，影响胰蛋白酶酶解物得率的各因素排序为：B=D>A>C=E，即加酶量和酶解温度的影响最大，酶解时间和pH的影响最小；其最佳酶解条件为一A1B4C1D2E4，即料液比为1∶1，加酶量为2 500 U/g，酶解时间为4 h，酶解温度为45 ℃，pH 为9。

2.1.2 以DPPH自由基清除率为指标。

以DPPH自由基清除率为指标，采用L16（4.5）正交试验确定鳕鱼皮多肽胰蛋白酶解的最佳条件见表3。

对表3正交试验结果进行极差分析，结果显示，影响胰蛋白酶酶解物得率的各因素排序从大到小依次为A、B、D、C、E，即料液比的影响最大，pH的影响最小；其最佳酶解条件为A1B2C1D1E1，即料液比为1∶1，加酶量为1 500 U/g，酶解时间4 h，酶解温度为40 ℃，pH 为6。

综合分析以上2种方法，认为最优酶解条件为A1B4C1D2E4，即料液比为1∶1，加酶量为2 500 U/g，酶解时间为4 h，酶解温度为45 ℃，pH为9。然后在该条件下按“1.3.1”方法大量提取得到大西洋鳕鱼皮多肽的粗提物。

2.2 多肽对DPPH自由基的清除能力

经超滤得到的5个组分，依次命名为MD-Ⅰ、MD-Ⅱ、MD-Ⅲ、MD-Ⅳ、MD-Ⅴ，配制成浓度为1.0、2.5、5.0、10.0和15.0 mg/mL濃度组，分别测定其DPPH自由基清除率，并以抗坏血酸（VC）为对照组。从图1可看出，随着浓度增加，活性肽MD-Ⅰ、MD-Ⅱ、MD-Ⅲ、MD-Ⅳ、MD-Ⅴ对DPPH自由基的清除能力也随之增加，即两者之间具有量效关系，但随着分子段的减少，对DPPH自由基的清除能力也随之增加。而与同浓度的抗坏血酸相比，活性比较低。其中，MD-Ⅴ（分子段≤5 kD）的DPPH清除能力较强，在浓度15 mg/mL时其清除能力最强，为75.23%。

2.3 多肽对ABTS自由基的清除能力 不同浓度和不同分子段活性肽对ABTS的清除能力结果见图2。随着浓度增加，活性肽MD-Ⅰ、MD-Ⅱ、MD-Ⅲ、MD-Ⅳ、MD-Ⅴ对ABTS的清除能力也随之增加，具有量效关系，但与同浓度的抗坏血酸相比，活性较低。其中MD-Ⅴ（分子段≤5 kD）活性最强，在浓度为15 mg/mL时清除能力最高，达到99.50%。

2.4 多肽对Fe.2+螯合能力测定 从图3可看出，随着浓度增加，活性肽MD-Ⅰ、MD-Ⅱ、MD-Ⅲ、MD-Ⅳ、MD-Ⅴ对Fe.2+螯合能力也随之增加，具有量效关系，但与同浓度的EDTA相比，活性较低。其中MD-Ⅴ（分子段≤5 kD）活性最强，在浓度为10 mg/mL时整合能力最高，达到77.83%。

3 结论

该试验用胰蛋白酶提取大西洋鳕鱼皮多肽，采用了L16（4.5）正交试验，分别以游离氨基氮含量和DPPH自由基清除率为筛選指标，综合考虑后，确定的最佳条件为料液比为1∶1，加酶量为2 500 U/g，酶解时间为4 h，酶解温度为45 ℃，pH为9，在此条件下，鳕鱼皮多肽具有最高的提取率。

将酶解液超滤后获得5个分子段，依次为分子量>30 kD（MD-Ⅰ）、>10～30 kD（MD-Ⅱ）、>8～10 kD（MD-Ⅲ）、>5～8 kD（MD-Ⅳ）、≤5 kD（MD-Ⅴ），经抗氧化试验，发现随着酶解液浓度的增加，分子量的减少，当分子量≤5 kD时对DPPH自由基清除、ABTS自由基清除力增加，但比同浓度的VC低；对Fe.2+螯合能力测定结果表明，分子量≤5 kD时活性最强，但较同浓度的EDTA相近，其余组分活性偏低。因此认为经胰蛋白酶提取的大西洋鳕鱼皮多肽具有较好的抗氧化活性，这将为鳕鱼皮的功能产品研发提供试验依据，有望开发保健药品等。

参考文献

[1]吴缇， 陈舜胜.鱼皮胶原蛋白的制备及性能研究进展[J].内陆水产，2008，33（9）：34-37.

[2] 傅燕凤， 沈月新.浅谈鱼皮胶原蛋白的利用[J].食品研究与开发，2004，25（2）：16-18.

[3] 赵海英，梁程超，缪锦来，等.鳕鱼皮胶原蛋白的制备及其成分分析[J].中国海洋药物， 2005，24（5）：30-32.

[4] 陈洁，胡晓赟.蛋白水解物的抗氧化性研究与展望[J].中国食品学报，2011，11（9）：111-119.

[5] 刘春娥，刘峰，李刚杰，等. 鳕鱼皮胶原蛋白酶解液的制备及抗氧化研究[J].安徽农业科学，2011，39（34）：21328，21344.

[6] 沈楚仪，杨最素.鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备与活性研究进展[J].安徽农业科学，2018，46（1）：16-17，51.

[7] 张桂和，赵谋明，巫光宏.方格星虫酶解物成分分析及其抗氧化作用[J].食品与生物技术学报，2007，26（3）：80-84.

[8] 肖月娟，李润丰，郑立红，等.斑鰶鱼蛋白控制酶解及其酶解物抗氧化活性研究[J].中国食品学报，2010，10（5）：91-97.