一株野生大型真菌的菌种分离及ITS序列鉴定

宋立志　冯连荣　梁德军　矫丽曼　张妍

摘要 [目的]寻找适宜杨树林下栽培的野生食用菌菌种。[方法]对采集自辽宁省阜新市蒙古族自治县银中杨林下的野生大型真菌进行菌种分离，同时研究不同分离部位对菌丝生长的影响，并对获得菌丝进行了rDNA ITS序列分析。[结果]菌盖与菌柄连接处为菌种最佳分离部位。对分离株rDNA ITS 片段进行PCR扩增，扩增产物长度为692 bp，登录NCBI与GenBank中已知的菌种进行Blast比对，序列与Agaricus bitorquis（Quél.）Sacc的Query cover为97%～100%，ident均为99%。[结论]鉴定分离菌种为蘑菇科、蘑菇属、大肥菇。该研究可为下一步开展杨-食用菌复合经营提供菌种准备。

关键词 杨树；野生大型真菌；菌种分离；ITS序列鉴定；大肥菇

中图分类号 S718.81 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）14-0113-03

Isolation and Identification of ITS Sequences of a Wild Macrofungi

SONG Lizhi， FENG Lianrong， LIANG Dejun et al

（Liaoning Institue of Poplar，Gaizhou， Liaoning 115213）

Abstract [Objective]To find suitable strains of wild edible fungi cultivated under poplar forests. [Method]Wild macrofungus under Populus alba forest collected from Mongolia Autonomous County， Fuxin City， Liaoning Province was isolated and the effects of different separation sites on mycelium growth were studied. The rDNA ITS sequences of mycelium were studied.[Result]The junction between the cap and stipe was the best separation site for the fungus. The rDNA ITS fragment was amplified by PCR， the length of the amplified product was 692 bp. The Blast comparison was performed between NCBI and a known strain in GenBank. The Query cover between sequence and Agaricus bitorquis（Quél.） Sacc was 97% to 100%， the idents were all 99%.[Conclusion]The identified strains belong to mushroom family， mushroom genus and Agaricus bitorquis.The study can provide the preparation of strains for the nest stage of poplaredible fungus compound management.

Key words Poplar；Wild macrofungi；Isolation of strains；ITS sequence identification；Agaricus bitorquis

我國是世界上杨树人工林面积最大的国家[1]，其中辽宁省是我国杨树发展的重要省份之一。但杨树生产周期长、见效慢，直接经济效益来得晚而且很低，因此如何搞好林地综合开发利用、找到林业经济增长点，是党和各级政府关心的问题。近年来杨-粮[2-4]、杨-草[5-6]、杨-食用菌[7-10]等复合经营成为杨树产业发展的重要方向。食用菌作为一种传统林副产品，非常适合林下栽培，成本低、收益高，杨-食用菌复合经营近年来备受青睐。

根据林地条件，筛选适宜林下栽培的食用菌菌种，是林下食用菌栽培技术的重要组成部分，也是决定林下栽培食用菌成功与否的首要因素[11]。平原地区杨树林下受环境条件限制，野生食用菌资源种类、数量远不及山区，所以寻找适宜杨树林下栽培的食用菌品种至关重要。笔者从银中杨林下采集一种野生大型真菌，对菌种进行分离及鉴定，为下一步开展杨-食用菌复合经营提供菌种准备。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种。

供试大型真菌子实体于2016年5月12日采自辽宁省阜新市阜新蒙古族自治县银中杨（Populus alba×P.berolinensis）树下。阜新蒙古族自治县气候属北温带半干旱季风大陆性气候区；多年平均日照数为2 865.5 h，年均气温7.2 ℃，≥10 ℃活动积温3 298.3 ℃，有效积温1 607.3 ℃，无霜期150 d左右；年平均降水量500 mm左右，5—9月份降水量425 mm，占全年的85%。

1.1.2 培养基。

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15 g，水1 000 mL，pH自然。称取马铃薯200 g并切成1 cm2的小块，放入水中煮沸20～30 min，用八层纱布进行过滤，过滤后加入葡萄糖、琼脂，继续加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1 000 mL，分装锥形瓶，121 ℃、0.15 MPa高压灭菌20 min，备用。

1.1.3 酶及生化试剂。

Taq DNA 聚合酶，购自Thermo公司；TIANGEN DNAsecure新型植物基因组DNA提取试剂盒，购自北京天根生化科技有限公司；引物采用真菌通用引物ITS1、ITS4，由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，引物序列为

ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

1.2 方法

1.2.1 菌种分离。

将采集的子实体用75%乙醇轻轻擦拭2～3遍，在超净工作台中，将子实体沿菌盖中央轻轻掰开，用解剖刀分别在子实体菌柄、菌盖及菌柄与菌盖交界处取6 mm左右的菌肉接种至PDA平板培养基中，每个平皿接种1块菌肉，重复5次，用封口膜封口后于25 ℃条件下培养，每天观察菌丝生长情况。当有菌丝长满平皿时结束培养，采用十字交叉法测量菌丝直径，计算菌丝日均生长速度（mm/d）。

1.2.2 菌丝DNA提取及凝胶电泳检测。

将分离得到的菌种命名为FM512，接种到PDA平板培养基中，25 ℃下静置培养7 d后，刮取菌落边缘的新鲜菌丝，使用DNAsecure新型植物基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA提取，具体操作按说明书进行，将提取的DNA置于-20 ℃保存备用。取6 μL提取的DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，用Syngene G：BOX凝胶成像系统进行拍照。

1.2.3 ITS-PCR扩增及序列比对。

以基因组DNA为模板，应用真菌通用引物对ITS1和ITS4进行PCR扩增，ITS-PCR扩增体系为10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，引物（10 μmol/L）0.5 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，模板DNA 1 μL，用ddH2O补足至25 μL。PCR扩增程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min，终止温度为4 ℃。反应结束后取6 μL产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送至TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司进行测序。测序结果登录GenBank进行Blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）比对。

2 结果与分析

2.1 子实体形态特征

对采集的子实体形态特征（图1）描述如下：子实体大，菌盖直径7.5 cm，扁半球形，顶部略下凹，白色；边缘内卷，无鳞片；菌肉白色，厚，紧密，菌褶白色，后变粉红色到黑褐色，离生，不等长；菌柄短，粗壮，5.0 cm×3.0 cm，白色，内实，近圆柱形；菌环双层，白色，膜质，生菌柄中部；孢子印深褐色，孢子褐色。

2.2 子实体不同部位对分离的影响

将FM512从子实体的不同部位进行分离培养，3个部位的菌丝在生长速度上有一定差异（表1），其中菌柄菌盖交界处菌丝生长快于菌盖、菌柄处，3个处理菌丝长势和菌丝浓密程度差异不大（图2）。

2.3 菌丝DNA提取及ITS-PCR扩增

将提取的DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测（图3），DNA条带清晰、较明亮，无明显后拖尾现象，说明基因组DNA完整，可以作为PCR反应的模板。以DNA为模板，ITS1、ITS4为引物对rDNA ITS区段PCR扩增，结果显示片段大小约为700 bp（图4），与预期结果一致。

2.4 序列比对

rDNA ITS区段序列测定结果显示，PCR扩增产物长度为692 bp，测序结果登录NCBI经Blast比对，结果表明，与FM512相似性最高前10位的菌株均为Agaricus bitorquis（Quél.）Sacc，Query cover为97%～100%，ident均为 99%，确定FM512为Agaricus bitorquis（大肥菇）。

3 结论与讨论

对于野生食用菌的鉴定，判断所获得无性培养菌丝是否是从原子实体分离获得，单从菌丝的形态不能完全准确进行判断。随着分子生物学技术的发展，国际核酸库信息资源不断丰富，ITS等分子鉴定手段逐渐被人们关注。将ITS序列与GenBank数据库进行Blast检索比对，序列相似性≥99%，可以鉴定为相同种[12]。笔者对采自阜新蒙古族自治县银中杨林下的野生大型真菌FM512进行了组织分离，适宜分离部位菌盖和菌柄交界处优于菌盖、菌柄处。对获得的菌丝进行了ITS-PCR扩增，经序列比对鉴定FM512为大肥菇，属担子菌亚门（Basidiomycotina）、层菌纲（Hymenomycetes）、伞菌目（Agaricales）、蘑菇科（Agaricaceae）、蘑菇属（Agaricus）。

参考文献

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