响应面法优化树舌灵芝多糖提取工艺

杜鹏瑶 王丽红 刘德江 张云杰

摘要 [目的]探讨热水提取法提取树舌灵芝多糖（soluble polysaccharides from Ganoderma applanatum，GASP）的最佳提取工艺。[方法]在单因素试验的基础上，运用响应面法对提取的树舌灵芝多糖（GASP）各项参数进行优化。[结果]提取时间、提取温度、液料比均对树舌灵芝多糖提取率有显著影响，影响大小为提取时间>液料比>提取温度;最终确定树舌灵芝多糖提取的最佳工艺条件为提取温度77 ℃、提取时间138 min、液料比27∶1（mL∶g），该条件下多糖实际提取率为2.57%±0.05%。[结论]响应面法优化树舌灵芝多糖提取工艺参数切实可靠。

关键词 树舌灵芝;多糖;提取;响应面

中图分类号 R284.2文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）34-0148-04

树舌灵芝[Ganoderma applanatum （Pers.） Pat]别名树舌、树舌扁灵芝、平蓋灵芝，隶属于担子菌门（Basidiomycota）非褶菌目（Aphyllophorales）灵芝菌科（Ganodermataceae）灵芝属（Ganoderma Karst），是药食同源的大型高等真菌[1]。我国大部分省区均有分布[2]，且广泛分布于欧洲、亚洲、北美洲等地区的其他国家[3]。树舌灵芝药用见于《中国药用真菌图鉴》和《长白山植物药志》，其性平，微苦，能抗癌、止痛、清热、化积、止血、化痰、消炎解毒[4]。研究表明，树舌灵芝还具调节免疫力、抗肿瘤、保肝、抗菌、抗病毒、抗氧化、降血压等生物活性[5-11]。多糖作为一种天然高分子化合物，具有广泛的生物活性，近年来受到广大学者们的重视。而树舌灵芝多糖（soluble polysaccharides from Ganoderma applanatum，GASP）作为树舌灵芝的活性成分之一，也受到医药工作者的重视，关于其报道也最多。

目前提取多糖常用的方法有水提法、超声提取法、微波提取法、酶提取法、超临界流体萃取法、酸提法、碱提法等[12-14]。而水提法是实验室提取多糖最常用的方法之一，该方法具有经济环保、操作简单、对设备要求低等优点。最重要的是与其他方法相比，对天然活性物质的结构影响小，因此被广泛应用于包括多糖的水溶性活性成分的提取研究[15]。笔者采用热水提取法对树舌灵芝多糖（GASP）进行提取，并在提取条件单因素的基础上进行响应面法优化，以确定水提树舌灵芝多糖最佳提取工艺，为树舌灵芝多糖规模化开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

树舌灵芝采至黑龙江省佳木斯市汤原县鹰山，经佳木斯大学生药学教研室王丽红教授鉴定为树舌灵芝（Ganoderma applanatum）。试验所用葡萄糖、浓硫酸、苯酚、乙醇均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

FW135中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）;FA2004N型电子分析天平（上海恒平科学仪器有限公司）;HH-24型恒温水浴锅（郑州长城科工贸有限公司）;UV-2550型紫外可见分光光度计（岛津公司）。

1.3 方法

1.3.1 树舌灵芝多糖的提取。

取清洗过后的树舌灵芝子实体放至烘箱，50 ℃烘干至恒重，粉碎过40目筛，制得树舌灵芝干粉。精密称取树舌干粉3.0 g，用80%乙醇浸泡24 h，乙醇用量刚好没过料面即可，抽滤，80%乙醇洗脱滤渣至滤液澄清，自然晾干。按试验方案所需液料比、提取温度、提取时间、提取次数进行提取，抽滤，离心，浓缩至固定体积，所得溶液即为树舌灵芝粗多糖提取液。

1.3.2 葡萄糖标准曲线的绘制。

精密称取干燥恒重的标准葡萄糖10 mg，定容于100 mL容量瓶中，配制成浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液。精密移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL的葡萄糖标准品溶液，分别置于具塞试管中，依次加水定容至2 mL，另取2.0 mL蒸馏水作空白对照。然后加入1.0 mL浓度5%的苯酚溶液，摇匀，迅速加入5 mL浓硫酸，摇匀后待试管冷却至室温即可。在波长490 nm处测定吸光值，以所测吸光值为纵坐标，标准葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线，并求出线性回归方程及相关系数。

1.3.3 粗多糖含量及提取率的测定  。

将所得粗多糖溶液稀释至适当倍数后得样品溶液，精密移取样品溶液2 mL，按测定标准曲线的方法测定吸光度，由回归方程计算树舌灵芝粗多糖溶液中多糖的浓度，按下式计算树舌灵芝粗多糖溶液中多糖的含量：多糖含量（m0）=C·V·X;多糖得率（%）=m0/m×100%。式中，C为样品溶液中多糖的浓度（mg/mL），V为样品溶液体积（mL），X为稀释倍数，m为树舌灵芝干重（g），m0为多糖含量（mg）。

1.4 单因素试验设计

1.4.1 液料比对树舌灵芝多糖提取率的影响。

准确称取6份质量相同的树舌灵芝干粉3.0 g，按树舌灵芝粗多糖提取工艺流程“1.3.1”进行操作，设置液料比为15∶1、25∶1、35∶1、45∶1、55∶1、65∶1（mL∶g，下同），在70 ℃条件下浸提2 h，提取3次，根据所测吸光度考察液料比对树舌灵芝粗多糖得率的影响。

1.4.2 提取温度对树舌灵芝多糖提取率的影响。

准确称取6份质量相同的3.0 g灵芝干粉末，按树舌灵芝粗多糖提取工艺流程进行操作，按液料比 45∶1加入蒸馏水，设置提取温度分别为50、60、70、80、90、100 ℃，浸提2 h，提取3次。根据所测吸光度考察提取温度对树舌灵芝多糖提取率的影响。

1.4.3 提取时间对树舌灵芝多糖提取率的影响。

准确称取6份质量相同的5 g灵芝干粉末，按液料比45∶1加入蒸馏水，设置提取时间分别为30、60、90、120、150、180 min，在70 ℃条件下提取3次，根据所测吸光度考察提取时间对树舌灵芝粗多糖得率的影响。

1.4.4 提取次数对树舌灵芝多糖提取率的影响。

准确称取6份质量相同的5 g灵芝干粉末，按液料比45∶1加入蒸馏水，设置提取次数分别为1、2、3、4次，在70 ℃条件下浸提2 h。根据所测吸光度考察提取次数对树舌灵芝粗多糖得率的影响。

1.5 响应面试验设计

通过单因素试验确定各因素变量范围，选择提取温度（A）、提取时间（B）及液料比（C）为主要影响因素。运用Design Expert 8.0软件进行3因素3水平Box-Behnken试验设计，试验因素及水平编码如表1所示。根据公式（1）计算出多元二次回归数学模型，进行数据回归分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线线性考察结果

根據葡萄糖对照品浓度（C）与吸光度值（A）的线性关系得回归方程A=67.428 57C-0.112 19，R2=0.999 5，说明葡萄糖浓度与吸光度值的线性关系良好。

2.2 单因素结果分析

2.2.1 液料比对树舌灵芝多糖提取率的影响。

由图1可知，液料比在15∶1～35∶1范围内，GASP提取率与液料比呈正相关;在35∶1时最大，提取率可达2.18%;而液料比超过35∶1以后，随着液料比的增大GASP提取率呈下降趋势。这可能是因为在一定范围内，随着液料比的增大可以提高植物细胞内外溶剂的浓度差，从而使水溶性多糖迅速溶出从而提高多糖提取率[16]，但液料比达到一定值后，液料比太大，浓缩时间延长，导致多糖损失[17]。综合考虑，选择35∶1为BBD（Box-Behnken Design）试验液料比的中心点。

2.2.2 提取温度对树舌灵芝多糖提取率的影响。

由图2可知，在一定提取范围内，GASP提取率随着提取温度的升高而增大，提取温度在80 ℃时GASP提取率最高可达2.05%;提取温度超过80 ℃以后，随着温度的升高GASP提取率呈下降趋势。这可能因为温度上升到一定水平时，由温度过高引起部分多糖结构破坏而降解[18]，从而使GASP提取率降低。因此选择80 ℃为BBD试验提取温度的中心点。

2.2.3 提取时间对树舌灵芝多糖提取率的影响。

图3表明，GASP提取率随着温度的升高呈先上升后下降的趋势，在120 min时达到峰值2.08%。这可能因为处理时间太短，样料中的多糖不能充分溶解;而时间太长，会使多糖降解为各种单糖，导致提取率下降[19]。因此选择120 min为BBD试验提取时间的中心点。

2.2.4 提取次数对树舌灵芝多糖提取率的影响。由图4可以看出，GASP提取率随着提取次数的增加而提高，提取次数从1次增加到3次，GASP提取率从1.13%增加到2.11%，增幅比较明显，从3次到5次提取率几乎趋于稳定。综合考虑，为节约资源，简化操作，确定BBD试验提取次数的中心点为3次。

2.3 响应面优化结果分析

2.3.1 Box-Behnken模型建立及试验结果。

通过响应面设计Box-Behnken对GASP提取率建立数学模型，优化提取工艺参数，共有17个试验点，12个分析因子，5个零点。以分析因子为自变量在A、B、C构成三维顶点;零点为区域的中心点。零点试验重复5 次，用以估算试验误差[20]。以GASP提取率为响应值，试验结果见表2。

2.3.2 响应面回归模型的建立及显著性检验。

运用Design-expert 8.0软件对表2中的GASP提取率进行回归分析，建立回归模型。根据公式（1），得GASP提取率回归方程（编码方程）为：Y=2.54+0.10×A+0.38×B-0.32×C-0.12×A×B+0.33×A×C-0.23×B×C-0.38×A2-0.50×B2-0.36×C2。

模型的F值为49.3 P<0.000 1**，表明该试验所得拟合方程回归模型具有高度显著性。失拟项P>0.05，不显著，表明该模型的稳定性较好;调整决定系数R2=0.984 5，表明GASP提取率约98.45%是由独立变量决定;决定系数R2Adj=0.964 5，变异系数C.V.%=5.50%，表明该模型的相关性高，拟合度较好，能很好地模拟GASP真实提取率与各变量之间的关系。概率值P<0.05说明该模型项是显著的;P<0.01说明该模型项为极其显著。根据回归模型方差分析可知：FA=7.18，PA=0.031 5*;FB=98.06，PB<0.000 1**;FC=68.21，PC<0.000 1**;FAB=4.99，PAB=0.060 7;FAC=37.67，PAC=0.000 5**;FBC=18.54，PBC=0.003 5**;FA2=51.54，PA2=0.000 2**;FB2=89.46，PB2=0.000 1**;FC2=46.77，PC2=0.000 2**。可见，A为显著项;B、C、AC、BC、A2、B2 、C2均为极显著项。

2.3.3 等高线图及响应面图分析。

为比较直观地了解各因素之间交互作用是否显著，以期进一步优化试验工艺，运用Design-expert 8.0软件对GASP提取率响应值分析作图，得到由响应值、A、B、C因素所构成的三维空间图及其三维空间在二维平面上的等高线图，分析结果见图5～7。

由图5中的三维空间图可知，该试验在所选范围内存在极值，既是三维曲面的最高点，又是等高线图椭圆的中心点。与A方向比较，B方向的效应面曲线较陡，B等高线的密度显著高于沿A方向移动的密度，说明提取时间（B）对GASP提取率的影响显著高于提取温度（A）;等高线呈圆形，表明提取时间（B）与提取温度（A）的交互作用不显著。

由图6可以看出，与A方向比较，C方向的效应面曲线较陡，C等高线的密度显著高于沿A方向移动的密度，说明液料比（C）对GASP提取率的影响显著高于提取温度（A）;等高线呈椭圆形，表明液料比（C）与提取温度（A）的交互作用显著。

由图7可以看出，与C方向比较，B方向的效应面曲线较陡，B等高线的密度显著高于沿C方向移动的密度，说明提取时间（B）对GASP提取率的影响显著高于液料比（C）;等高线呈椭圆形，表明提取时间（B）与液料比（C）的交互作用显著。因此，各因素对GASP提取率影响大小为提取时间（B）>液料比（C）>提取温度（A）。

2.3.4 响应面模型验证。

根据所得到的模型，预测最佳提取工艺条件为提取温度77.04 ℃、提取时间137.91 min、液料比27.33∶ 在该条件下GASP提取率的理论值可达2.76%。考虑到试验的实际操作性，将提取条件修正为提取温度77 ℃、提取时间138 min、液料比27∶1。试验重复3次，所得GASP实际提取率为2.57%±0.05%，该结果与理论值较为吻合。

3 结论

该研究在单因素试验的基础上，运用Box-Benhnken响应面法对树舌灵芝多糖的提取条件进行优化，结果表明：提取温度、提取时间、液料比均对树舌灵芝多糖提取率有显著影响，影响大小为提取时间>液料比>提取温度;最终确定树舌灵芝多糖提取的最佳工艺条件为提取温度77 ℃、提取时间138 min、液料比27∶ 在该条件下多糖实际提取率为2.57%±0.05%。可见，运用响应面法优化树舌灵芝多糖提取工艺参数切实可靠，为树舌灵芝多糖的开发利用奠定了理论基础。

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