PFT—α对鸡传染性喉气管炎病毒侵染宿主细胞的影响

孙邦耀 邵昱昊 高琦 李海 刘胜旺

摘要[目的]研究抑癌基因p53小分子抑制劑PFT-α对ILTV侵染宿主细胞的影响。[方法]用PFT-α处理LMH（鸡肝癌细胞），通过结晶紫染色技术检测细胞感染ILTV 24 h后的细胞死亡情况，通过流式细胞术检测PFT-α对ILTV吸附、进入LMH细胞的影响，通过倒置荧光显微镜和高内涵细胞筛选系统检测PFT-α对ILTV在细胞间扩散的影响。[结果]结晶紫染色表明，PFT-α促进了ILTV感染后的细胞死亡，流式细胞术结果表明，PFT-α对ILTV吸附细胞没有影响，但是促进了ILTV进入细胞。同时，倒置荧光显微镜和高内涵细胞筛选系统检测结果表明，PFT-α对ILTV在细胞间扩散没有影响。[结论]研究初步检测了PFT-α对ILTV侵染LMH细胞过程的影响，为进一步研究ILTV与宿主互作过程提供了理论补充。

关键词传染性喉气管炎病毒；病毒吸附；病毒进入；病毒扩散

中图分类号S852.65文献标识码A文章编号0517-6611（2018）05-0087-04

Abstract[Objective]To research the effect of PFTα， a p53 inhibitor， on laryngotracheitis virus（ ILTV） infecting host cells.[Method]In present study， we detected the effect of PFTα on cell death， ILTV binding and penetration as well as transmission between LMH cells by stained with 0.1% crystal violet， flow cytometry and observing expression of EGFP using fluorescence microscopy and Operetta CLS highcontent analysis system. [Result]Crystal violet staining result showed that PFTα promoted LMH cells death after ILTV infection. Flow cytometry results showed that PFTα had no effect on viral binding but promoted penetration of ILTV. Results of both fluorescence microscopy observation and Operetta CLS highcontent analysis system showed that PFTα had no effect on ILTV transmission between LMH cells. [Conclusion]Our findings have advanced our understanding about how ILTV infection host cells and provided another promising option for controlling AILT.

Key wordsInfectious laryngotracheitis virus；Virus binding；Virus penetration；Virus transmission

鸡传染性喉气管炎（avian infectious laryngotracheitis，AILT）是鸡的一种高度接触性传染病，其临床症状主要包括呼吸困难、咳嗽和产蛋下降等[1]。该病于1925年被首次报道于美国，目前分布于世界各地[2]。AILT的病原为传染性喉气管炎病毒（infectious laryngotracheitis virus，ILTV），属于疱疹病毒科（Herpesviridae）α亚科（Alphaherpesvirinae）中的鸡疱疹病毒1型（Gallid herpesvirus 1）[3]。ILTV为线性双股DNA囊膜病毒，直径为195～250 nm。

和其他α疱疹病毒一样，ILTV在急性入侵上呼吸道后会潜伏于神经系统内，从而逃避宿主免疫监视，当宿主免疫力低下时ILTV又从潜伏状态中激活，造成疫情暴发。当前，AILT防疫主要依靠接种减毒活疫苗所产生的免疫应答，但给鸡群注射减毒活疫苗时也存在散毒的风险，引起机体潜伏感染，从而逃避宿主免疫监视，使得清除困难[4]，因此难以长效地防制AILT。研究ILTV侵染宿主细胞的过程能帮助人们更深入地理解ILTV的传播与致病机理[5]，从而为AILT的防制提供新的思路。有研究表明，在ILTV感染机体的过程中，细胞免疫应答而非体液免疫应答起到决定性作用[6]，因此研究ILTV在细胞间的扩散显得尤为重要。该研究通过结晶紫染色、流式细胞术、倒置荧光显微镜以及高内涵细胞筛选系统检测了抑癌基因p53小分子抑制剂PFT-α对ILTV吸附和进入LMH细胞、ILTV在LMH细胞间扩散以及ILTV感染后的细胞死亡的影响，以期为研究ILTV侵染宿主过程提供试验基础，也为完善现有AILT防控体系提供新的思路。

1材料与方法

1.1材料与试剂

LMH细胞（鸡肝癌细胞）、抗ILTV gI糖蛋白多克隆抗体、带GFP标签的病毒株ILTV-EGFP为哈尔滨兽医研究所禽呼吸道病创新团队实验室保存；ILTV-EGFP的TCID50为10-4.56/0.1 mL；0.1%结晶紫染色液、红色荧光染料Dil、R18及生物活性小分子PFT-α、FITC标记的抗兔二抗均购自于Sigma公司；0.1 μm PVDF膜滤器购自于美国Millipore公司；所用离心机为Allegra X-15R台式冷冻离心机（美国，Beckman Coulter）。

1.2结晶紫染色

以ILTV感染复数（病毒感染复数=感染性病毒颗粒/被感染细胞数，感染性病毒颗粒以PFU计算，PFU= TCID50×0.69[7]，下同）为0.1的剂量接种LMH细胞，并分别在ILTV感染前后各以PFT-α（20 μmol/L）处理细胞，对照组为相同体积的DMSO，待各个处理组细胞死亡现象在肉眼观测下差异明显时进行结晶紫染色，弃去细胞上清，用70%乙醇室温固定30 min，弃掉固定液待室温下风干后用0.1%的结晶紫细胞室温染色40 min，之后回收结晶紫染色液，用PBS洗去细胞表面残留的染色液，室温风干后拍照。

1.3病毒制备

待T25细胞瓶中LMH细胞长满单层后接种ILTV-EGFP，MOI为0.1，待细胞病变达70%以上时将细胞在-80 ℃下反复冻融3次以充分释放病毒，将病毒液以12 000 r/min离心10 min，取病毒上清分别用Dil（3 μmol/L）和R18（3 μmol/L）染色，室溫下避光孵育20 min，然后用0.1 μm 的PVDF膜滤器过滤病毒液，此时病毒滞留在滤膜上，再用2 mL左右无血清培养基冲洗滤器，最后将滤器置于无血清培养基中往回倒抽以回收病毒，病毒液过滤体积∶病毒液回收体积为 2∶1。

1.4PFT-α对ILTV吸附细胞影响的检测

将PFT-α对ILTV吸附细胞的影响采取两种方法进行检测。方法一：待24孔板中LMH细胞长满单层后接种PFT-α（20 μmol/L），对照组为相同体积的DMSO，孵育12 h后用胰酶消化细胞，1 200 r/min离心5 min收集细胞，弃掉上清后加入500 μL Dil染色后回收的病毒液，将细胞悬起混匀，置于4 ℃内让病毒避光吸附1 h，之后1 200 r/min离心5 min收集细胞，弃掉上清后加入500 μL PBS重悬细胞并过300目铜筛网置样品于流式细胞管中待测。

方法二：待24孔板中LMH细胞长满单层后接种PFT-α（20 μmol/L），对照组为相同体积的DMSO，孵育12 h后用胰酶消化细胞，1 200 r/min离心5 min收集细胞，弃掉上清后加入500 μL未染色的病毒液，将细胞悬起混匀后置于4 ℃内让病毒吸附1 h，之后1 200 r/min离心5 min收集细胞，弃掉上清后加入1%BSA稀释的抗ILTV gI糖蛋白的兔多克隆抗体，gI抗体∶1%BSA=1∶10，以兔IgG作为对照，4 ℃孵育1 h后1 200 r/min离心5 min收集细胞，弃掉上清后加入1% BSA稀释的FITC标记的抗兔二抗，二抗稀释比例为1∶300，4 ℃内避光孵育30 min后1 200 r/min离心5 min收集细胞，弃掉上清后加入500 μL PBS重悬细胞并过300目铜筛网置样品于流式细胞管中待测。

1.5PFT-α对ILTV进入细胞影响的检测

待24孔板中LMH细胞长满单层后弃掉上清，用无血清培养基轻轻洗掉细胞表面残留的血清，加入500 μL R18染色后回收的病毒，置于4 ℃让病毒避光吸附1 h，之后加入PFT-α（20 μmol/L），对照组为DMSO，在4 ℃内孵育1 h后转移至37 ℃、5%CO2培养箱内孵育1 h让病毒进入细胞，待病毒充分进入后收集细胞，用流式细胞仪检测病毒进入情况。

1.6PFT-α对ILTV在细胞间扩散影响的检测

以MOI为1的剂量给24孔板中长满单层的LMH细胞接种ILTV-EGFP，待病毒充分进入后将细胞消化离心，将此感染细胞与另外未感染病毒的LMH细胞混匀后共同接种96孔板（6孔板），两者比例为1∶50，待细胞贴壁后加入PFT-α（20 μmol/L）及DMSO，并且在细胞表面铺一层低熔点琼脂糖凝胶，另一组不铺胶作为对照，之后于6、18和24 h在高内涵细胞筛选系统（倒置荧光显微镜）下检测EGFP荧光表达情况。

2结果与分析

2.1PFT-α对细胞感染ILTV后细胞死亡的影响

以ILTV感染复数为0.1的剂量接种LMH细胞，并分别在ILTV感染前后各以PFT-α（20 μmol/L）处理宿主细胞，对照组为DMSO，在病毒感染24 h后做结晶紫染色。结果如图1所示，和对照组相比，PFT-α处理组细胞死亡明显更多，说明PFT-α促进了ILTV感染后的细胞死亡。

2.2PFT-α对ILTV吸附细胞的影响

用PFT-α孵育LMH细胞后用Dil预染的ILTV吸附细胞，流式细胞术结果显示，和对照组相比，PFT-α处理组的Dil荧光密度均值（MFI）没有显著变化（P>0.05），这表明PFT-α对ILTV吸附细胞没有影响（图2a）；应用抗ILTV gI糖蛋白的兔多克隆抗体的方式通过流式细胞术进行检测，也得到了相似的结论（图2b）。综上所述，PFT-α对ILTV吸附细胞没有影响。

2.3PFT-α对ILTV进入细胞的影响

在对LMH细胞接种R18预染的病毒后，先使病毒在4 ℃条件下吸附1 h，然后添加PFT-α并4 ℃孵育1 h，之后将细胞转移至37 ℃、5%CO2培养箱内让R18预染的病毒进入细胞。流式细胞术结果显示，和对照组相比，PFT-α处理组R18的荧光密度均值显著增加（P<0.05）。以上结果说明，PFT-α促进了ILTV进入细胞（图3）。

2.4PFT-α对ILTV在细胞间扩散的影响

ILTV在细胞间以2种方式进行扩散，即游离扩散和细胞-细胞间扩散，禽呼吸道病实验室分别对2种方式进行了检测。按照“1.5”中的方法操作，待混合培养的感染细胞与未感染细胞在96孔板（6孔板）内贴壁后，通过在LMH细胞表面添加低熔点琼脂糖凝胶的方式阻断病毒在细胞上清中的游离扩散，然后通过观察EGFP荧光信号来检测PFT-α对ILTV在细胞-

細胞间扩散的影响，同时通过高内涵细胞筛选系统统计病毒感染后不同时间点的EGFP荧光面积。结果显示，随着病毒感染时间的推移，EGFP表达逐渐增多，但和对照组相比，PFT-α对EGFP的表达没有显著影响（P>0.05，图4a和b）。结果表明，PFT-α对ILTV在细胞-细胞间扩散没有影响；另外，在未加低熔点琼脂糖凝胶的共培养系统里，病毒以2种方式进行扩散。观察结果表明，PFT-α对EGFP的表达也没有显著影响（P>0.05，图5a和b）。综上所述，PFT-α对ILTV的游离扩散和细胞-细胞间扩散均没有影响。

3讨论

AILT每年都会给世界养禽业造成巨大的经济损失。目

前，疫苗接种仍然是防控AILT的主要措施，它能有效地防止ILTV感染。但和强毒株一样，疫苗毒也会引起鸡群潜伏感染[8]，从而逃避宿主免疫监视，使AILT反复暴发，很难根除。因此探索一种更为安全有效的AILT防控新策略至关重要。

研究ILTV与宿主之间的相互作用尤其是ILTV的传播机制至关重要，它可以帮助人们更好地理解ILTV的复制、毒力和发病机理，并为完善现有AILT防控体系提供了新的切入点。病毒吸附、病毒进入和病毒在细胞间扩散是病毒侵染宿主细胞的重要步骤。病毒吸附和病毒进入是病毒侵染宿主细胞的初始环节，而病毒在细胞内复制后通过扩散去感染新的宿主细胞。在体内病毒主要以2种方式进行扩散，即游离扩散和细胞-细胞间扩散。游离扩散是指病毒在感染细胞内大量复制后释放至外周环境中，然后借助外周环境进行远端扩散；细胞-细胞间扩散指病毒借助细胞间形成的通道进行扩散。和细胞-细胞间扩散相比，游离扩散很容易被体液中的中和抗体所阻断，不利于病毒的存活[9-10]。目前，关于人疱疹病毒1型和牛疱疹病毒1型在宿主细胞间扩散的研究均有报道[11-14]，然而，关于ILTV在细胞间扩散的研究知之甚少。此外，有研究表明，宿主Src（原癌基因酪氨酸激酶）作为主要调节因子调控ILTV感染过程[15]，但该研究并未阐明Src调控ILTV在宿主细胞间传播的具体机制。该研究中，以ILTV感染LMH细胞为体外研究模型，初步探讨了抑癌基因p53小分子抑制剂PFT-α对ILTV侵染宿主细胞的影响。通过结晶紫染色发现，PFT-α促进了ILTV感染后的细胞死亡。通过对ILTV进行Dil染色和应用抗ILTV gI糖蛋白抗体2种方式检测，该研究发现PFT-α对ILTV吸附细胞没有影响。通过R18染色的方式对ILTV进入宿主细胞的影响进行检测。R18是一种二聚体小分子红色荧光染料，此时本身荧光自淬灭。当标记有R18染料的ILTV囊膜与细胞膜发生融合时，R18在细胞膜上随着细胞膜的流动被稀释成单体，可以产生荧光信号，直接反映病毒进入宿主细胞的能力。流式细胞术结果指出，PFT-α可促进ILTV进入细胞。通过观察和统计感染细胞和未感染细胞共培养系统里的EGFP荧光表达情况表明，PFT-α对ILTV的游离扩散和细胞-细胞间扩散均没有影响。该研究结果提示，可通过改变ILTV侵染宿主细胞的环节来影响病毒的致病过程。该研究为研究ILTV侵染宿主过程提供了试验基础，也为完善现有AILT防治体系提供了新的思路。

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