金华佛手精油纳米乳制备及其对HT—29细胞体外增殖的抑制作用

孙小涵 寇兴然　吕文平　王洪新

摘要 [目的]研究制备佛手精油纳米乳的工艺及纳米乳对HT-29细胞增殖的抑制作用。[方法]以佛手精油和MCT混合为油相，吐温（Tween-80）为表面活性剂，通过高压均质法制备佛手精油纳米乳（O/W型），并探讨纳米乳对HT-29细胞增殖的抑制作用。以粒径大小和多分散性指数（PDI）为指标优选高压均质法参数，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测纳米乳对细胞增殖的抑制影响。[结果]油相质量百分比10%（佛手精油和MCT质量比4 ∶1），乳化剂的质量百分比2.00%，在均质压力10 000 Psi，均质次数3次的工艺条件下，得到的佛手精油纳米乳粒径为100～120 nm，PDI在0.3以下。[结论]佛手精油纳米乳对HT-29细胞增殖有明显抑制效果，且呈剂量依赖型。

关键词 佛手精油；纳米乳；抑制

中图分类号 S-3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）18-0144-06

Preparation of Jinhua Fingered Citron Essential Oil Nanoemulsion and Its Inhibitory Effect on Proliferation of HT29 Cells in vitro

SUN Xiaohan1，2，KOU Xingran1，2， L Wenping1，2 et al

（1. The State Key Laboratory of Food Science & Technology，Wuxi，Jiangsu 214000；2. School of Food Science & Technology， Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu 214000）

Abstract [Objective]To study the process of preparing fingered citron essential oil nanoemulsion，and the inhibitory effect of nanoemulsion on the proliferation of HT29 cells.[Method]This article studied the process of preparing fingered citronessential oil nanoemulsion （O/W type） by highpressure homogenization， using fingered citron essential oil and MCT mixed as oil phase and Tween80 as surfactant. The inhibitory effect of nanoemulsion on the proliferation of HT29 cells was explored. The parameters of highpressure homogenization method were used as the index of particle size and PDI， and the inhibitory effect of nanoemulsion on cell proliferation was detected by MTT assay. [Result]The mass percentage of oil phase was 10% （mass ratio of fingered citron essential oil and MCT was 4 ∶1）， the mass percentage of emulsifier was 2.00%， and it was obtained under the conditions of homogeneous pressure of 10 000 Psi and 3 times of homogenization.The fingered citron essential oil nanoemulsion had a particle size of 100-120 nm and a PDI less than 0.3.[Conclusion]The fingered citron essential oil nanoemulsion significantly inhibited the proliferation of HT29 cells in a dosedependent manner.

Key words Fingered citron essential oil；Nanoemulsion；Inhibition

佛手（fingered citron），學名Citrus medica L.var.Sarcodactylis Swingle，又名佛手香橼、蜜柑、蜜罗柑、福寿柑、五指柑等，属芸香科柑橘属香橼的变种，为常绿小乔木或灌木[1]。金华佛手主产于金华市赤松镇山口等地，其果挥发油含量高达1.6%，所得挥发油为无色透明液体，芳香扑鼻，香气极为浓郁。有研究表明，佛手精油主要成分是萜烯类、倍半萜烯类以及高级醇类、醛类、酮类、酯类等多种生理活性物质，具有较高的药用价值，具有祛痰、止咳、平喘、抗焦虑、抗菌消炎和去除自由基等作用[2]。现代药理学研究表明，植物精油具有广泛的药理活性，可有效抑制肝癌、子宫颈癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、人白血病细胞、人卵巢癌细胞等多种癌细胞增殖，是一类具有开发价值的抗肿瘤中药[3-6]。

植物精油常温下不稳定，易挥发，在水中的溶解度极低。在储藏过程中散失，导致其活性降低，该试验选择纳米乳为基质，以提高其稳定性和溶解度，且制备过程在室温下进行，有效地降低了精油损耗，从而达到缓释的目的。

纳米乳是一种液相以液滴形式分散于第二相的胶体分散体系，属于非热力学稳定体系，颗粒粒度为50～200 nm[7-8]。纳米乳因其纳米级粒径可防止聚集和重力引起的乳液分离，具有抗沉降和乳析的动力学稳定特性，精油纳米级乳化体系可以提高精油的水溶性、稳定性和生物利用度[9]。笔者研究了佛手精油纳米乳的制备工艺及其对HT-29细胞体外增殖的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜金华佛手（浙江金手宝生物科技有限公司）；聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯（Tween-80）（化学纯，上海国药集团）；磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠、无水硫酸钠、二甲基亚砜（分析纯，上海国药集团）；亚甲基蓝、苏丹红（指示剂，上海国药集团）；中链甘油三酯（MCT，上海慈太龙实业有限公司）；人结肠癌细胞株HT-29（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）；绵羊血（无菌，杭州新锐生物工程有限公司）；RPMI-1640 基础培养基、青霉素/链霉素溶液、胎牛血清（美国Gibco公司）；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司）。

1.2 仪器与设备

纳米粒度及Zeta电位分析仪（Zetasizer nano ZS）（英国马尔文公司）；高速剪切机（德国IKA公司）；NanoFast-15A型高压均质机（MORGEC公司）；HZT-A600型电子天平（福州华志科学仪器有限公司）；JEM-2010HT透射电子显微镜（日本电子株式会社）；DG250小型厌氧工作站（英国DWS公司）；生物安全柜（美国Labconco公司）；BD150L三气培养箱（德国Bingd公司）；PYX-DHS隔水式恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）；磁力搅拌器（德国IK-A公司）；MLS-3750高压蒸汽灭菌锅（日本三洋公司）；通风橱（上海飞域公司）；Leica DM2000显微镜（德国Leica光学仪器公司）；HEPA Class 100型细胞培养箱（美国赛默飞公司）；UV-2100紫外可见分光光度计（优尼科上海有限公司）；5242R型高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；细胞培养板（美国Corning公司）；DK-S12恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）；SP-250生化培养箱（南京实验仪器厂）。

1.3 佛手精油的制备

称取适量的成熟新鲜金华佛手，洗净切块，经高速组织捣碎机破碎后转移至烧瓶中，加入适量的去离子水，加入沸石，连接挥发油测定器与回流冷凝管。用电热套缓缓并保持微沸约4 h。收集精油，加入适量的无水硫酸钠，在6 000 r/min、4 min、25 ℃的条件下离心进行油水分离，即可得到佛手精油产品。

1.4 佛手精油纳米乳的制备

将MCT和佛手精油按比例混合即为油相，向其中加入适量的Tween-80，混合均匀后将混合液倒入磷酸缓冲液（pH=7，0.5 mmol）中，使样品总质量达50 g。用高速剪切机10 000 r/min剪切5 min，得粗乳，使用高压均质机10 000 Psi，均质3次，即得佛手精油纳米乳。

1.5 佛手精油纳米乳的质量评价

1.5.1 佛手精油纳米乳类型的鉴定。

通过染色法[10]鉴定纳米乳类型。分别将油溶性的蘇丹红溶液和水溶性的亚甲基蓝溶液滴到制备好的纳米乳中，观察2种染色剂在纳米乳中的扩散速度，如果苏丹红的扩散速度大于亚甲基蓝，该乳液为油包水型（W/O）；如果亚甲基蓝的扩散速度大于苏丹红，该乳液为水包油型（O/W）；二者扩散速度相同则为双连续型。

1.5.2 佛手精油纳米乳形态观察。

取适量的佛手精油纳米乳样品，用磷酸缓冲液稀释100倍后，滴加在覆盖碳膜的铜网上，用质量分数为 2.0%的磷钨酸负染30 s，自然挥干，在透射电镜下观察纳米乳的形态[11]。

1.5.3 佛手精油纳米乳的稳定性。

将制备好的纳米乳装入玻璃瓶中，密封，在4、25、40 ℃的条件下，放置0、5、10 d，取适量稀释后的纳米乳于离心管中，15 000 r/min离心20 min，观察是否出现絮凝、聚结、分层絮凝现象。

1.6 佛手精油纳米乳抑制HT29细胞体外增殖作用

1.6.1 细胞培养。

将HT-29细胞加冻存液保存于液氮（-196 ℃）中。复苏时，置于细胞培养瓶中，加入RPMI-1640细胞完全培养液，于5%CO2培养箱中37 ℃培养，每2 d换液1次，当细胞融合至70%～80%，用0.25%胰酶-EDTA消化传代，细胞贴壁生长，通常2 d更换培养液，4 d进行传代，传代5次左右进行试验。

1.6.2 精油及其纳米乳对HT-29细胞形态学影响的观察。

将生长融合至70%～80%的HT-29细胞进行消化，调整浓度至2×105 个/mL，将无菌盖玻片放置在6孔细胞培养板中，每孔加入2 mL细胞培养悬液，于5% CO2培养箱中37 ℃培养，待细胞长至单层时，用PBS清洗3次，加入含有精油及其纳米乳的RPMI-1640完全培养液（精油及其纳米乳的浓度梯度为0、31.25、62.50、125.00、250.00 μg/mL），于5% CO2培养箱中37 ℃培养24 h，取出盖玻片后于倒置显微镜下观察细胞的形态。

1.6.3 MTT法测定精油及其纳米乳对HT-29细胞体外增殖的抑制。

采用0.25%胰酶-EDTA消化生长融合至70%～80%的HT-29细胞，调整浓度至1×104个/mL，每孔加入200 μL细胞培养悬液于96孔板中，5%CO2培养箱中37 ℃培养24 h后，弃去培养上清液，PBS清洗3次，加入含精油及其纳米乳的RPMI-1640完全培养液（精油及其纳米乳的浓度梯度为0、31.25、62.50、125.00、250.00 μg/mL），每种浓度设置6个复孔，并设置空白纳米乳和空白对照组，37 ℃、5%CO2培养箱中孵育24 h后，每孔加入MTT溶液10 μL，继续培养4 h后，小心吸去上清液，每孔加入DMSO150 μL，室温置于微量振荡器上振荡10 min，自动酶标仪（570 nm）下测量各孔的吸光度值，按下列公式计算细胞抑制率：

柠檬精油纳米乳同时被作为对照进行了研究。由图7可知，细胞在柠檬精油纳米乳的最低浓度（31.25 μg/mL）下处理24 h后便体现出明显的凋亡特征，其效果高于佛手精油纳米乳。

2.3.2 MTT法测定佛手精油及其纳米乳对HT-29细胞的生长抑制作用。

HT-29结肠癌细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶可将四唑盐类物质（MTT）还原为紫色的结晶物，沉淀在细胞周围，而死细胞无此功能，二甲基亚砜能溶解细胞中的结晶物，用酶标仪读取吸光度值，从而检测到细胞增殖状态，这种方法快速、灵活，是一种比较常用的检测细胞增殖的手段。

由图8可知，不同浓度的佛手精油和佛手精油纳米乳（31.25、62.50、125.00、250.00 μg/mL）作用于HT-29细胞后，细胞抑制率分别为10.8%、20.4%、41.2%、53.7%和10.7%、35.9%、71.3%、78.3%。空白对照组与空白纳米乳组之间并无显著性差异。这种现象说明将佛手精油制成纳米乳之后，在相同的浓度下，佛手精油纳米乳抑制细胞增殖的效果大大增强，但是这种增强效果并不是由纳米乳基质造成的。通过和柠檬精油纳米乳对比，佛手精油纳米乳与柠檬精油纳米乳对细胞的抑制率相似。

试验中佛手精油纳米乳对细胞的抑制作用远远大于佛手精油，可能是由于纳米乳的颗粒小、比表面积大、吸附能力更强，可以很快地吸附在细胞表面。由于纳米乳中表面活性剂的亲水亲油性，更有利于精油在水中的溶解。纳米乳作为佛手精油的药物载体，协助精油跨过细胞膜，使细胞内药物浓度相对升高，明显增强药效。

3 结论与讨论

近年来的研究发现，细胞凋亡受阻可能是肿瘤发病的重要机制，治疗肿瘤的新思路趋向于诱导肿瘤细胞凋亡。该试验研究了高压均质法制备佛手精油纳米乳的最佳工艺：油相质量分数10%（MCT ∶佛手精油为1 ∶4），乳化剂2.00%，用高速剪切机10 000 r/min剪切5 min，高压均质机10 000 Psi，均质3次。并采用不同浓度的佛手精油及其纳米乳作用于人结肠癌细胞HT-29，MTT法检测不同药物对HT-29细胞的生长抑制作用，结果表明62.50 μg/mL的佛手精油就可抑制HT-29细胞的增殖，同等浓度下，佛手精油纳米乳的抑制效果远高于精油原液。试验测得3种纳米乳的IC50分别为佛手精油201.039 μg/mL，柠檬精油纳米乳98.159 μg/mL，佛手精油纳米乳91.246 μg/mL。随着药物浓度的增加，抑制作用增强，呈现明显的剂量依赖型。说明佛手精油及其纳米乳对人类结肠癌细胞有一定的抑制作用，但抑制机理还需要进一步的研究。

有研究表明，佛手精油中的主要成分是萜类物质柠檬烯和蒈烯。经前期试验，佛手精油的主要成分为D-柠檬烯，柠檬精油的主要成分为（-）-柠檬烯，其相对含量分别占53.26%和79.27%。早在20世纪70年代，人们就发现柠檬烯具有抗肿瘤活性。柠檬烯抗癌机制主要有化学预防作用、抑制细胞周期与诱导细胞凋亡以及抑制肿瘤的侵袭与转移等。近年来，人们对柠檬烯的抗癌活性进行了广泛的研究，并发现其抗癌功效具有广谱性[16]，对乳腺癌、肝癌、结肠癌等均具有抑制作用，并能减轻各种癌症带来的损伤[17]。麻艷芳等[18]研究结果表明，佛手挥发油具有抑制MDA-MB-435癌细胞增殖的作用，低、中浓度的佛手挥发油诱导细胞凋亡且将细胞周期阻滞在S期和G2/M期，而高浓度的佛手挥发油引起细胞坏死。吕学维等[19]研究结果表明佛手挥发油可有效杀伤体外培养的小鼠B16黑色素瘤细胞，低中剂量的佛手挥发油可诱导细胞凋亡，高剂量的佛手挥发油可致细胞坏死。

该研究证实了佛手精油及其纳米乳对HT-29细胞的抑制作用，随着药物浓度的增加，抑制作用增强，呈现明显的剂量依赖型。说明佛手精油及其纳米乳对人类结肠癌细胞有一定的抑制作用，但抑制机理还需要进一步研究。

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