新优绿化植物冬红离体培养与组培快繁技术研究

余平福 蓝学 覃林海

摘要 [目的]建立冬红组培再生体系。[方法]从外植体消毒、外植体出芽诱导、无菌芽继代增殖、壮苗、生根、移栽等方面建立冬红组培再生体系。[结果]用75%乙醇30 s+0.1%HgCl2 10 min+0.2%HgCl2 5 min进行外植体消毒效果最好；较好的外植体出芽诱导培养基为MS+ 6-BA 0.2 mg/L+ IBA 0.4 mg/L+蔗糖3.0%，诱导率为80%；继代增殖培养基：改良MS +6-BA 0.5 mg/L+ KT 0.5 mg/L +NAA 0.2 mg/L+蔗糖4.0%的有效苗最多，增殖系数为3.8；壮苗培养基以改良MS +6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L +蔗糖3.0%的效果最好；生根培养基1/3MS+NAA 0.5 mg/L+蔗糖1.5%的生根率最高，达85%；移栽基质以泥炭土∶黄泥∶河沙（V∶V∶V=1∶1∶1）的混合基质较好，30 d后移栽成活率高达90%。[结论]该研究基本建立了冬红组培快繁技术体系，为实现冬红组培苗木批量化生产奠定了理论基础。

关键词 冬红；组培快繁；增殖；壮苗；生根；移栽

中图分类号 S723.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）18-0083-03

Technical System of Tissue Culture on Holmskioldia sanguinea Retz.

YU Pingfu， LAN Xue， QIN Linhai

（Guangxi Weidu State Forest Farm， Laibin， Guangxi 546100）

Abstract [Objective]To establish the tissue regeneration system of Holmskioldia sanguinea Retz. .[Method]A technique system of tissue culture of H. sanguinea Retz.was established from the aspect of explant disinfection，sterile bud proliferation，strong seedling， rooting and transplanting.[Result]The best sterilization method was 75% alcohol 30 s+0.1%HgCl2 10 min+0.2%HgCl2 5 min；explants induction media was MS+ 6BA 0.2 mg/L+ IBA 0.4 mg/L+ sucrose （3.0%）， induction rate was 80%；subculture multiplication media was modified MS +6BA 0.5 mg/L+ KT 0.5 mg/L +NAA 0.2 mg/L + sucrose （4.0%）， multiplication coefficients reached 3.8；growthpromoting culture media was modified MS+6BA 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L +sucrose （3.0%）；rooting culture media was 1/3MS+ NAA 0.5 mg/L +sucrose （1.5%）， and the rooting rate was up to 85%；the best transplantation media was peaty soil ， yellow soil and fine sand mixture matrix （V∶V∶V=1∶1∶1）， and transplanting survival rate could reach 90% after 30 days .[Conclusion]This study basically established the rapid propagation technology system of H. sanguinea Retz.， which laid a theoretical foundation for the realization of the batch production of seedlings of H. sanguinea Retz..

Key words Holmskioldia sanguinea Retz.；Tissue culture；Multiplication；Buds growthpromoting；Rooting；Transplantation

冬紅（ Holmskioldia sanguinea Retz.）原产于喜马拉雅，为马鞭草科冬红属植物，又名阳伞花、帽子花，花顶生，聚伞花序，花冠呈弯曲筒状而微扁平，橙红色，它的花在冬季依然能呈现出绚丽的红色，极为鲜艳夺目，故而得名[1]。冬红枝条伸长具蔓性，耐修剪，适用于花架、花廊、坡墙和围篱绿化、盆栽等，可在我国的热带和南亚热带地区栽培[1]。由于冬红是难得的冬季开花植物，景观价值高且适应性强，且种植范围广，因此是城市绿化和乡村美化的优良种质资源[2]，市场上对其苗木需求量大。通过组培快繁技术，可实现短周期、大批量地推广冬红优质种苗，满足市场需求。在冬红组培快繁方面，国内鲜有相关研究报道。笔者以冬红带腋芽茎段为外植体，研究冬红组培关键技术，拟建立一套成熟的冬红组培再生体系，填补相关方面的技术空白，为批量化生产冬红组培苗木提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料（外植体）为冬红长势健壮、无病虫害、半木质化的带腋芽枝条。外植体采集应尽量选择在连续晴天3 d以上的天气，于中午进行。

1.2 外植体消毒及培养

摘去外植体叶片，剪成合适长度的带芽茎段，进行消毒处理。在无菌条件下，使用75%乙醇、0.1%HgCl2、0.2% HgCl2和NaClO共4种灭菌剂，设置不同的灭菌剂浓度和灭菌时间组合（表1），将灭菌的外植体最后用无菌蒸馏水冲洗6遍，风干后接入MS基本培养基中。每个处理50瓶，每瓶接入1芽。10 d后观察结果，统计污染率，进行对比分析，筛选出最佳外植体消毒方法。

1.3 诱导及继代培养

培养基以MS培养基为基础，根据无菌苗的生长状况和培养需要进行适当改良，调节培养基pH至5.8，琼脂6%，附加生长调节剂6-BA、KT、IBA、NAA等。

1.3.1

外植体出芽诱导培养。将消毒获得的无菌外植体分别转接到出芽诱导培养基上，出芽诱导培养基以MS为基本培养基，蔗糖3.0%，生长调节剂配比如下：C1，6-BA 0.1 mg/L+ IBA 0.2 mg/L；C2，6-BA 0.2 mg/L+ IBA 0.4 mg/L；C3，6-BA 0.5 mg/L+ IBA 1.0 mg/L。每个处理20个重复，每个重复1个外植体，20 d后统计诱导率。

1.3.2

增殖培养。将无菌芽单个切下，接种至增殖培养基中。增殖培养以改良的MS培养基为基本培养基，蔗糖4.0%，生长调节剂配比如下：C4，6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L；C5，6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；C6，6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.5 mg/L；C7，6-BA 0.5 mg/L+ KT 0.5 mg/L +NAA 0.2 mg/L。每个处理20个重复，每个重复1个芽，20 d后统计增殖系数，增殖系数=增殖所得芽数/接入的外植体总数。

1.3.3

壮苗培养。壮苗培养基以改良的MS培养基为基本培养基，蔗糖3.0%，生长调节剂配比如下：C8，6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L；C9，6-BA 0.1 mg/L+IBA 0.2 mg/L；C10，NAA 0.2 mg/L；C11，IBA 0.2 mg/L。將增殖培养获得的不够健壮的无菌丛芽单个切下，接种至壮苗培养基中，每个处理20个重复，每个重复1个芽，20 d后观察苗的生长情况。

1.3.4

生根培养。选取健壮、高度为4～6 cm的无菌苗进行生根培养。培养基以1/3 MS为基本培养基，蔗糖1.5%，所含生长调节剂如下：C12，NAA 0.5 mg/L；C13，NAA 1.0 mg/L；C14，IBA 0.5 mg/L；C15，IBA 1.0 mg/L。每个处理20个重复，每个重复1个芽，20 d后统计生根率。

1.4 炼苗移栽

当生根苗在培养瓶内具3～4根长约2 cm的根系时，即可出瓶移栽，出瓶前炼苗3～5 d。移栽基质采用以下3个配比：C16，黄泥；C17，泥炭土∶黄泥（V∶V=1∶1）；C18，泥炭土∶黄泥∶河沙（V∶V∶V=1∶1∶1）。每个处理移20株苗，放置育苗棚内，进行同样的水肥管理，分别于15、30 d后统计移栽成活率。

2 结果与分析

2.1 外植体消毒效果

不同的消毒处理效果差异明显。由表1可知，当使用75%乙醇和NaClO消毒时，污染率最高，效果达不到预期，消毒处理后，外植体上还有很多存活的霉菌和细菌。在设置的4种消毒处理中，污染率最低的为处理3，但是其存活率极低，外植体大部分褐变死亡。处理4（75%乙醇30 s+0.1%HgCl2 10 min+0.2%HgCl2 5 min）的效果最好，在获得较低污染率的同时，保证了存活率，且所得无菌外植体依然保有活力。

2.2 不同生长调节剂浓度对外植体出芽诱导的影响

3种培养基上冬红外植体的出芽诱导率见表2。C1和C2培养基都能成功诱导外植体长新芽且无愈伤，接种20 d后新芽长势强壮，但C2培养基诱导率明显高于C1培养基。相反，C3培养基可能由于生长调节剂浓度过高，外植体上产生大量愈伤组织，出芽诱导率最低，芽畸形，新叶卷曲玻璃化。可知，用C2培养基（MS+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.4 mg/L）对冬红外植体进行出芽诱导培养效果最好。

2.3 不同生长调节剂浓度对继代增殖的影响

由表3可知，生长调节剂浓度是影响无菌芽增殖的关键因素，无菌芽的增殖随着细胞分裂素总浓度的升高而增多，当6-BA浓度为2.0 mg/L，NAA浓度为0.5 mg/L时，无菌芽的增殖系数最高，获得的丛芽最多，但是有效苗较少，分生芽的生长受到抑制，生长较慢，长势弱。综合而言，效果最好的增殖配方是C7培养基（6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 0.5 mg/L），细胞分裂素6-BA、KT和生长素NAA配合使用，增殖芽苗生长健壮，畸形苗率低，增殖系数较高，平均增殖系数为3.8，是诱导增殖的理想生长调节剂配比，增殖效果如图1所示。

2.4 不同生长调节剂浓度对壮苗培养的影响

对于部分增

殖获得的不够健壮的无菌芽丛进行复壮培养，结果见表4。合适浓度的生长素和低浓度细胞分裂素6-BA配合使用，能够有效促进冬红无菌苗复壮。从试验结果可知，生长素NAA比IBA的促生效果更好，当0.2 mg/L NAA配合0.1 mg/L 6-BA使用时，无菌芽的复壮效果最好，生长快且健壮，增殖获得的小芽叶片浓绿有光泽，可用于再次增殖培养或者直接用于生根。单独使用生长素的效果不及生长素和细胞分裂素配合使用，当培养基中仅添加0.2 mg/L NAA时，无菌芽生长快，但是芽纤细且基部产生愈伤较多，不利于生根培养或继代增殖；当培养基中仅添加0.2 mg/L IBA时，无菌芽有一定程度的复壮，但是生长较慢。

2.5 不同生根剂处理对无菌苗不定根发生的影响

4种不同浓度生根剂对冬红无菌苗不定根发生的影响见表5。NAA处理的生根效果明显好于IBA，其生根率高，根系粗壮旺盛，当NAA浓度为0.5 mg/L时，生根率最高，达85%。IBA处理的生根率都较低，根系均少且弱。不同批次的试验结果表明，生根效果除了与生长调节剂有关系外，无菌苗本身的因素也有影响，不同继代次数的无菌苗经同样的生根剂处理后，生根率会有差异，这可能与组培苗的木质化程度、体内的生长调节剂积累等因素有关。针对不同继代苗的生长特性，对生根剂处理和培养基进行适当的调整，生根率基本保持在80%以上。图2为在C12培养基上，冬红无菌苗根系发达粗壮。

2.6 炼苗移栽

当生根组培苗经过开瓶炼苗后，洗净培养基，分别栽种到3种经过消毒的基质中，移栽试验结果见表6。由表6可知，不同基质中的移栽成活率不同，其中全黄泥的成活率最低，30 d时的成活率为70%，泥炭土∶黄泥∶河沙以体积比为1∶1∶1的混合基质最适合冬红组培苗的生长，30 d时已完全适应土壤基质和温室环境，生长健壮，抽出新梢，成活率高达90%。

3 结论与讨论

通过对冬红离体培养进行系统研究，建立冬红组培快繁技术体系如下：外植体消毒灭菌的最佳方法为75%乙醇30 s+0.1%HgCl2 10 min+0.2%HgCl2 5 min，外植体出芽诱导最佳培养基为MS+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.4 mg/L+蔗糖3.0%；继代增殖培养基以改良MS +6-BA0 .5 mg/L+KT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖4.0%的效果最好；最适壮苗培养基为改良MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖3.0%；生根培养基以1/3MS+ NAA 0.5 mg/L+蔗糖1.5%的效果最好；泥炭土∶黄泥∶河沙（V∶V∶V=1∶1∶1）混合基质是最适移栽基质。

培养材料的消毒是组织培养过程中的一个重要环节，是决定组织培养成败的关键。该研究中外植体采用冬红带腋芽茎段，带菌较多，对于这样的外植体，使用75%乙醇和NaClO进行灭菌，效果达不到预期。HgCl2的消毒效果优于NaClO，一般采用0.1%～0.2%消毒效果最好，但是其消毒时间较难掌握，当浓度低、消毒时间短时，消毒效果不理想，若浓度高、消毒时间长，则外植体褐化死亡，采用分段消毒法（浓度和消毒时间）可缓解这一矛盾，获得更好的灭菌效果[3-4]。

合理的生长调节剂配比是成功筛选获得各阶段成熟配方的关键。沈海龙[5]、胡繁荣[6]指出：要促进丛生芽的形成，就要提高细胞分裂素与生长素的比值，但浓度不宜过高；进行壮苗培养时，生长素的生物学效应高于细胞分裂素，笔者的研究结果也证实了该结论。该研究中，增殖培养时高浓度的6-BA（1.0～2.0 mg/L）或6-BA和KT（各0.5 mg/L）分别与较低浓度的NAA（0.2 mg/L）组合均能诱导芽增殖，且获得较高的增殖系数，6-BA与KT配合使用效果更佳；在壮苗培养时，稍高浓度的NAA（0.2 mg/L）与低浓度的6-BA（0.1 mg/L）组合能够使长势较弱的丛生芽复壮。生长素类型及使用浓度对组培生根效果影响显著[7-8]。就冬红而言，在该研究中NAA的促生根效果明显优于IBA，0.5 mg/L是其较合适的浓度。

该研究筛选获得了冬红离体培养的关键配方，在开展冬红组织培養时，要根据培养材料的具体情况，比如木质化程度、苗内生长调节剂积累和继代次数等，对培养基进行相应的优化调整。该研究基本建立了冬红组培快繁技术体系，为实现冬红组培苗木批量化生产奠定了理论基础。

参考文献

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[2] 裴鉴，陈守良，方文哲，等.中国植物志：第65卷第1分册[M].北京：科学出版社，1982.

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[4] 龚一富.植物组织培养实验指导[M].北京：科学出版社，2011.

[5] 沈海龙.树木组织培养微枝试管外生根育苗技术[M].北京：中国林业出版社，2009.

[6] 胡繁荣.植物组织培养[M].北京：中国农业出版社，2009.

[7] 叶飞，建德锋.合果芋组培苗的生根与移栽技术研究[J].江苏农业科学，2012，40（11）：196-197.

[8] 姚瑞玲，王胤，吴幼媚.马尾松组培生根关键因子分析[J].广西植物，2016，36（11）：1288-1294.