光叶山楂高效再生体系的建立

武玉婷 石岭 张建中 贾建宇 云利俊

摘要 [目的]建立光叶山楂高效再生體系。[方法]以光叶山楂茎尖为外植体，通过植物生长调节剂和培养基配比，建立光叶山楂高效再生体系。[结果]光叶山楂初代培养最适宜的培养基配方为1/4MS+ BA 0.1 mg/L；愈伤组织形成最适培养基配方为1/2MS+NAA 0.1 mg/L+CPPU 0.01 mg/L；继代培养最适宜的培养基配方为MS+BA1.0 mg/L和MS+BA1.5 mg/L+IAA0.1 mg/L；生根培养最适培养基为1/4MS+IAA1.0 mg/L；100 mg/L BA浸蘸嫩茎基部30 min，外植体的生根效果最好。[结论]该研究可为光叶山楂的开发利用提供参考。

关键词 光叶山楂；再生体系；培养基；植物生长调节剂

中图分类号 S661.5 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）18-0079-04

Establishment of Efficient Regeneration System of Crataegus dahurica Koehne

WU Yuting1，SHI Ling1，ZHANG Jianzhong2 et al

（1.College of Agronomy，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot，Inner Mongolia 010019；2.Hohhot Science and Technology Bureau，Hohhot，Inner Mongolia 010000）

Abstract [Objective]To establish the efficient regeneration system of Crataegus dahurica Koehne.[Method]This test used stem tip of C. dahurica Koehne as explant to establish the efficient regeneration system of C. dahurica Koehne through plant growth regulator and medium ratio.[Result]The optimal primary medium was 1/4MS + BA0.1 mg/L， the suitable medium for callus was 1/2MS + NAA0.1 mg/L + CPPU 0.01 mg/L，the optimal subculture medium was MS + BA1.0 mg/L and MS + BA1.5 mg/L + IAA0.1 mg/L， the suitable rooting medium was 1/4MS + IAA1.0 mg/L，the explants got the best rooting effect at 100 mg/L BA dipped in the base of young stem 30 min.[Conclusion]This study can provide reference for the development and utilization of C. dahurica Koehne.

Key words Crataegus dahurica Koehne；Regeneration system； Medium； Plant growth regulator

山楂属（Crataegus L.）植物属于蔷薇科（Rosaceae）植物，广泛分布于亚洲、欧洲、中北美洲及南美洲的北部，主要集中于北美洲，世界上共有该属植物1 000余种[1]。山楂在我国栽培利用有悠久的历史，《中国植物志》记载了我国山植属植物有17种2个变种[2]。光叶山楂（C.dahurica Koehne）是山楂属植物的一个种，主要分布于黑龙江、内蒙古以及西伯利亚和蒙古北部等地区。光叶山楂属落叶乔木或灌木，花色纯白，果实颜色较浅，果近球形或长圆形，具24小核，叶片大部分呈菱状卵形，通常两面无毛[3]；耐庇荫、耐寒、耐旱能力强，适应性广，常散生于河岸、山麓的兴安落叶松白桦混交林中[4]。

光叶山楂具有营养、保健、药理、生态等多方面的利用价值，对光叶山楂进行全面研究和开发利用尤为重要。虽然各国研究人员对山楂属植物进行了较为广泛的研究，但在深度上远不如其他蔷薇科果树[5]。利用组织培养技术对光叶山楂进行离体快繁，可在短期内生产大量优质原材料，缓解山楂种子萌发难、苗木繁殖慢的问题，为其深入研究提供材料；利用组织培养技术对光叶山楂进行抗性育种，可从根本上利用光叶山楂的优点进行品种改良，提高光叶山楂果实和苗木的利用率，对光叶山楂的开发利用有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

光叶山楂茎尖以及经组织培养获得的光叶山楂茎段。

1.2 方法

1.2.1 初代培养。

1.2.1.1

BA浓度及MS培养基对光叶山楂的影响。采用不同浓度BA（0.1、1.0 mg/L）及不同类型培养基（MS、1/2MS、1/4MS、1/8MS、1/16MS）组合共10个处理对光叶山楂进行培养，记为A1～A10，每瓶接种4个，每处理5瓶，重复3次，培养周期为90 d。

1.2.1.2

NAA及CPPU浓度对光叶山楂的影响。以1/2MS为基础培养基，分别添加不同浓度NAA（0、0.01、0.10 mg/L）与不同浓度CPPU（0.01、0.10 mg/L）组合共6个处理，记为A11～A16，每瓶接种4个，每处理5瓶，重复3次，培养周期为30 d。

1.2.2 继代培养。

1.2.2.1 BA濃度及MS培养基对光叶山楂的影响。剪取无菌苗带节茎段，接种于MS和1/2MS培养基上，分别添加不同浓度BA（0.1、0.5、1.0 mg/L），共6个处理，记为B1～B6，每瓶接种4个，每处理5瓶，重复3次，培养周期为30 d。

1.2.2.2 IAA及BA浓度对光叶山楂的影响。剪取无菌苗带节茎段，接种于MS基础培养基上，添加不同浓度IAA（0.1、0.5 mg/L）和BA（1.0、1.5、2.0 mg/L），共6个处理，记为B7～B12，每瓶接种4个，每处理5瓶，重复3次，培养周期为30 d。

1.2.3 生根培养。

1.2.3.1

生长素种类、浓度及培养基对光叶山楂的影响。选取继代培养后生长一致的光叶山楂无根苗，接种于含有不同浓度IAA（0.5、1.0、1.5 mg/L）以及IBA（0.5、1.0、1.5 mg/L）的2种培养基（1/2MS、1/4MS）上，共12种处理，记为C1～C12，每瓶接种4个外植体，每处理5瓶，重复3次，培养周期为90 d。

1.2.3.2

BA浸蘸时间对光叶山楂的影响。用100 mg/L BA浸蘸光叶山楂嫩茎基部，浸蘸时间分别为30、60 min，记为C13～C14，浸蘸后接种于不含任何植物生长调节剂的1/2MS培养基上，培养周期为90 d。

1.3 培养基及培养条件

各试验培养基均含有蔗糖3%、琼脂0.7%，用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl调pH至5.8～60，经121 ℃高压蒸汽灭菌20 min后凝固备用；外植体接种后，置于光照培养箱中培养，培养温度为（25±2） ℃，光照强度为1 500～3 000 lx，光照时数均为16 h/d。

2 结果与分析

2.1 初代培养

2.1.1 BA浓度及MS培养基对光叶山楂初代培养的影响。

由表1可知，在A2～A5处理下，光叶山楂茎尖生存率和平均株高均高于A7～A10处理，其中A4处理对光叶山楂茎尖生存率效果最佳为91.6%，A3处理嫩茎的平均高度最高达24.3 mm，在A1、A6和A10处理下，光叶山楂外植体均无嫩茎形成，A3～A5处理光叶山楂嫩茎形成率均高于A8～A10处理，其中A3处理是最利于嫩茎形成的处理组合，在A4和A8处理下，培养所得嫩茎增殖倍数相同且最高达2.0。

2.1.2 NAA及CPPU浓度对光叶山楂初代培养的影响。

由表2可知，A13、A15和A16处理下，光叶山楂茎尖生存率均达100%，A11和A14处理下，外植体无愈伤组织形成，A12和A13处理愈伤组织形成率均高于A15和A16处理，其中A13处理愈伤组织形成率达100%，A13和A16处理下，愈伤组织大小一致，均为6.2 mm。

2.2 继代培养

2.2.1 BA浓度及MS培养基对光叶山楂继代培养的影响。

由表3可知，6种处理下光叶山楂的生存率以及嫩茎形成率都很高，其中B1～B3以及B6处理下，生存率均为100%，除B3处理外，其他处理嫩茎形成率均为100%，B4处理下光叶山楂平均株高最大为30.1 mm，B2和B5处理下增殖倍数相同，B6处理下增殖倍数最大为3.6。

2.2.2 IAA及BA浓度对光叶山楂继代培养的影响。

由表4可知，6种处理均诱导形成嫩茎，其中B11处理下嫩茎形成率最高为83.6%，平均株高为13.4～18.1 mm，B8处理平均株高为18.1 mm，B8处理下光叶山楂嫩茎增殖倍数最大为2.4。

2.3 生根培养

2.3.1 培养基及生长调节剂对光叶山楂生根的影响。

由表5可知，IAA和IBA的浓度过高或过低均不利于光叶山楂无菌苗生根；在同一培养基下，同种浓度的IAA比IBA更利于无菌苗生根培养；当生长调节剂种类和浓度相同时，1/4MS培养基较1/2MS培养基更利于外植体生根。综合分析表明，C8处理是最利于光叶山楂生根的培养基及生长调节剂组合，外植体生根数11条、生根率55%、平均根长36.4 mm。

2.3.2 BA浸蘸嫩茎对光叶山楂生根的影响。

由表6可知，浸蘸BA均可诱导外植体生根，C13处理下，外植体生根数9条、生根率45%、平均根长50.1 mm，C14处理下外植体生根数仅1条、生根率仅有5%、平均根长12.2 mm，因此诱导生根较好的处理时间是30 min。

3 结论与讨论

3.1 初代培养

通过对光叶山楂初代培养进行研究，结果表明，在同一BA浓度下，光叶山楂外植体的生存率、嫩茎形成率、嫩茎增殖倍数及平均株高均随着MS培养基中大量元素含量的降低呈现先升高后降低的趋势，说明MS培养基中大量元素过高或过低均不利于光叶山楂的初代培养，在1/4MS培养基下，外植体初代培养的效果最好，因此，最利于光叶山楂茎尖初代培养的配方为1/4MS+BA 0.1 mg/L。

愈伤组织诱导是通过细胞内特定基因的激活和表达，形成特定的蛋白来调控的，其中起重要作用的是激素种类及配比[6]。该试验中，当CPPU浓度一定，NAA浓度为0时，外植体可以存活，但无愈伤组织形成；随着NAA浓度的增加，光叶山楂外植体生存率、愈伤组织形成率、愈伤组织大小均增大，说明在一定的浓度范围内，NAA可促进光叶山楂外植体的愈伤组织形成；当NAA浓度一定时，高浓度CPPU可促进愈伤组织生长，但愈伤组织形成率较小，说明CPPU抑制愈伤组织的形成但不抑制其生长，同时也证明了CPPU是一种非常有效的细胞分裂素[7]。因此，适宜光叶山楂愈伤组织形成的最适培养基配方为1/2MS+NAA 0.1 mg/L+CPPU 0.01 mg/L。

3.2 继代培養

通过研究不同浓度BA及培养基类型对光叶山楂外植体继代培养影响，结果表明，在1/2MS培养基中，外植体增殖倍数随BA浓度增大呈先增大后降低的趋势，说明BA浓度过大或过小都抑制外植体的增殖生长，在MS培养基中，增殖倍数随BA浓度增大而增大，当BA浓度一定时，MS培养基中外植体增殖倍数大于1/2MS培养基，由此可见，培养基中大量元素浓度越高越能促进外植体的增殖生长。当IAA浓度为0.1 mg/L时，外植体增殖倍数随BA浓度的增大呈先增大后降低的趋势，当IAA浓度为1.0 mg/L时，外植体增殖倍数随BA浓度的增大逐渐降低，可见外植体增殖倍数受BA与IAA共同调控。综合考虑，适宜光叶山楂继代培养的培养基配方为MS+BA1.0 mg/L和MS+BA 1.5 mg/L+IAA0.1 mg/L。

3.3 生根培养

对于实际生产来说，植物具有发达的根系才能吸收土壤中的水分和养分，因此组织培养中无菌苗的生根是组织培养快繁的关键[8]。该研究结果表明，1/2MS和1/4MS培养基中外植体生根率随IAA浓度的增大表现为先上升后下降的趋势，IAA浓度过高或过低均不利于外植体生根；同一浓度下IAA比IBA更利于生根；添加同种浓度的IAA下，1/4MS培养基外植体生根率高于1/2MS培养基，证明低浓度无机盐培养基更利于外植体生根，生根培养最适培养基为1/4MS+IAA1.0 mg/L。

用100 mg/L的BA浸蘸光叶山楂嫩茎基部后接种于不含植物生长调节物质的1/2MS培养基中，探索两步生根法对外植体生根率的影响，结果表明，BA浸蘸30 min外植体生根效果较好，BA浸蘸60 min抑制外植体的生根。

参考文献

[1] 侯宽昭.中国种子植物科属辞典[M].北京：科学出版社，1958：115.

[2] 中国科学院北京植物研究所.中国植物志：第36卷[M].北京：科学出版社，1974：189.

[3] 贾敬贤，贾定贤，任庆棉.中国作物及其野生近缘植物·果树卷[M].北京：中国农业出版社，2006.

[4] 印万芬.东北地区山楂属植物的种类分布和用途[J].特产科学实验，1983（1）：23-25，22.

[5] 李浚明.植物组织培养教程[M].北京：中国农业大学出版社，2004.

[6] 李浚明.植物组织培养教程[Z].北京：中国农业大学出版社，2004.

[7] BRUCE M I，ZWAR J A.Cytokinin activity of some substituted urea and thioureas[J].Proc Roy Soc B，1966，165：245-265.

[8] 龚一富.植物组织培养实验指导[M].北京：科学出版社，2011.