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大豆疫霉菌PsSed5编码基因转录分析及功能研究

2018-05-14赵伟迟元凯汪涛

安徽农业科学 2018年8期

赵伟 迟元凯 汪涛

摘要[目的]研究大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)SNARE家族之一的编码基因PsSed5转录及功能。[方法]利用实时定量PCR分析PsSed5在大豆疫霉不同生活史及侵染时间段的转录,利用PEG介导的原生质体稳定转化法,将该基因沉默后分析沉默转化子的表型。[结果]PsSed5是组成性表达,在侵染早期表达量较高,PsSed5的2个沉默转化子菌丝生长减慢,致病力减弱。[结论] PsSed5在大豆疫霉的生长发育及致病性方面都发挥着重要的调控作用。

关键词大豆疫霉;SNARE;PsSed5;基因沉默

中图分类号S188文献标识码

A文章编号0517-6611(2018)08-0105-03

Transcriptional Analysis and Functional Study of PsSed5 Gene of Phytopnthora sojae

ZHAO Wei,CHI Yuankai,WANG Tao et al(Institute of Plant Protection and Product Quality and Safety,Anhui Academy of Agricultural Sciences,Hefei,Anhui 230031)

Abstract[Objective] To analyze the transcription and the gene function of PsSed5,one of the SNARE proteins in Phytophthora sojae. [Method]Using the realtime PCR analyzed the PsSed5 expression in different developmental and infection stages.Using the PEGmediated DNA transformation obtained the PsSed5 silencing transformants to research its phenotype.[Result] The PsSed5 is constitutively expressed during various life stages and the course of infection,with the relatively highest expression levels in early infection,while the hypha from the silencing transformants growth slowly with weak pathogenicity.[Conclusion] The results show that PsSed5 is important for growth and contributes to the full virulence of P.sojae.

Key wordsPhytophthora sojae;SNARE;PsSed5;Gene silencing

基金项目安徽省自然科学基金项目(1508085MC43)。

作者简介赵伟(1980—),男,安徽寿县人,副研究员,博士,从事植物病理学研究。* 通讯作者,研究员,博士,从事真菌病害及综合治理技术研究。

收稿日期2018-01-22

大豆疫病是由大豆疫霉(Phytophthora sojae)引致的大豆毁灭性病害之一,在大豆不同生育时期均能发病,给大豆产业带来严重威胁。植物病原菌若要成功侵染寄主,必须破坏寄主植物的系列防卫反应系统,而寄主植物在感知病原菌侵染后,会产生主动的防卫反应,以达到破坏寄主侵入的目的。在這种漫长的相互斗争、克制与反克制过程中,病原菌进化出了复杂的侵染机制。病原菌通常使用某种毒性策略,如通过分泌一系列的外泌蛋白来改变寄主细胞的代谢途径,从而达到成功侵染的目的[1-2]。在真核生物中外泌蛋白的分泌需要膜泡运输参与调控,而SNARE(soluble Nethylmaleimidesensitive factor attachment protein receptors)蛋白是真核生物细胞膜泡运输过程中发生膜融合最重要的调控蛋白家族,在真核生物中较为保守。SNARE作为调控细胞生长发育必不可少的蛋白家族,在人类、酵母及植物病原真菌中得到了大量的研究。Sed5是SNARE蛋白家族成员之一,为QaSNARE亚基,是高尔基器膜泡转运系统的中心组分。在顺向运输过程中,Sed5与Sec22、Bos1、Bet1形成SNARE四聚复合体介导膜泡融合[3-4]。

笔者利用实时定量PCR分析PsSed5在大豆疫霉不同生活史及侵染时间段的转录,并利用PEG介导的原生质体稳定转化的方法将该基因沉默后分析沉默转化子的表型,明确其功能,以期为揭示SNARE蛋白对大豆疫霉生长发育及对大豆致病过程的分子机理提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株。大豆疫霉菌株P6497,由美国俄勒冈州立大学Brett M.Tyler教授馈赠,系大豆疫霉全基因组测序菌株,保存在10 ℃条件下的10%V8固体培养基上。

1.1.2大豆品种。大豆品种Williams,由南京农业大学国家大豆改良中心提供,该品种对大豆疫霉菌株P6497表现为感病。

1.2方法

大豆疫霉转化方法如下[5-6]:收集菌丝,将菌丝放入含有0.8 mol/L甘露醇的培养皿中漂洗,将漂洗过后的菌丝移入盛有0.8 mol/L甘露醇的离心管中室温摇洗10 min;用灭过菌的50 mL烧杯快速称取0.1 g 溶解酶和0.06 g 纤维素,盖紧杯口迅速拿回超净台。依次加入10 mL 0.8 mol/L甘露醇、8 mL H2O、800 μL 0.5 mol/L KCl、800 μL 0.5 mol/L MES (pH 5.7)和400 μL 0.5 mol/L CaCl2,充分溶解酶液后将其倒入50 mL离心管,并加入已洗好的菌丝,25 ℃ 40 r/min 酶解45~60 min;用20 mL针筒和细菌过滤器过滤40%PEG,将盛有PEG的烧杯封口后放于冰上备用;用2层Mira Cloth和烧杯过滤收集原生质体,收集好后倒入新的离心管中,1 500 r/min、3 min后轻轻倒去上清液;用35 mL W5 溶液洗涤原生质体,1 500 r/min、4 min后轻轻倒去上清液;用5 mL W5溶液重悬原生质体至浓度为2×106个/mL,冰置30 min后,1 500 r/min、4 min,轻轻倒去上清液;用5 mL MMg 溶液重悬原生质体,室温放置10 min;在每个含有质粒的离心管中加入1 mL原生质体,冰置5~10 min;每个离心管加1.74 mL PEG,冰置2 min;往离心管中加8 mL Pea/0.5 mol/L甘露醇缓慢颠倒1次;次日上午加热溶化Pea/0.5 mol/L甘露醇琼脂,降温至40 ℃以下后加入G418至浓度为30 μg/mL,混匀后倒入培养皿中25 ℃黑暗培养;待新生菌丝长出后,用含30 μg/mL G418的Pea/0.5 mol/L甘露醇覆盖平板,25 ℃黑暗培养;待菌丝从覆盖的Pea/0.5 mol/L甘露醇上长出后,用含50 μg/mL G418的Pea/0.5 mol/L甘露醇或利马豆培养基再次覆盖平板,25 ℃黑暗培养;挑取最终从平板上长出的菌落,于50 μg/mL G418利马豆培养基上继代培养。

用OMEGA Total RNA Kit I提取大豆疫霉菌不同生长阶段及侵染阶段的总RNA。提取的候选转化子的总RNA经DNAase消解后按照invitrogen M-MLV逆转录试剂盒使用指南合成单链cDNA,-20 ℃冰箱保存供实时定量PCR(Realtime quantitative PCR,qRT-PCR)使用。所用实时定量引物分别为qRTF1:5′-GGAGTTAGTGCCAGCGAGTC-3′ 和qRTR1:5′-AAGAGCTGTCCGATGTCCAC-3′,所用的内参基因为肌动蛋白编码基因,引物为PsactA-F:5′-ACTGCACCTTCCAGACCATC-3′ 和 PsactA-R:5′-CCACCACCTTGATCTTCATG-3′,定量分析及沉默转化子的筛选。用于验证外源转化子是否插入基因组的引物为载体上游引物HAMF1:5′-TTCTCCTTTTCACTCTCACG-3′和PsSed5基因的上游引物PsSed5F:5′- ATGGCGGCGAACCGCACGG-3′。

2结果与分析

2.1大豆疫霉菌PsSed5基因的克隆及序列结构分析

大豆疫霉中PsSed5基因(ID:303106,https://genome.jgi.doe.gov/Physo3

/Physo3.home.html)DNA和CDS全长序列分别从DNA和cDNA中被扩增出来,分别为1 214、996 bp,其中有3个内含子,蛋白序列由331个氨基酸组成。通过氨基酸生物信息学分析及结构预测,PsSed5氨基酸的234~301位氨基酸为SNARE核心保守功能区域,该区域与其他SNARE蛋白形成复合体,促进不同细胞膜间的融合;321~329位氨基酸为跨膜区域,将SNARE蛋白结合在细胞膜上。

2.2PsSed5在生活史阶段及侵染阶段的转录分析

为了更进一步了解及预测这些PsSed5编码基因可能具有的功能,对该基因在无性生活史及侵染阶段的转录谱进行了详细分析,所选阶段分别是V8液培的菌丝、产孢子囊的菌丝、游动孢子、休止孢、萌发的休止孢、侵染感病大豆品种1.5、3、6、12和24 h的菌絲。通过实时定量PCR分析可以发现,PsSed5在不同阶段均有较高的表达量,属于组成性表达基因,在侵染早期上调表达,说明其对疫霉菌的侵染或许有一定的调控作用(图1)。

2.3PsSed5沉默突变体的获得

为了进一步研究PsSed5在大豆疫霉生长发育及致病过程等方面的具体功能,利用PEG介导的原生质体稳定转化的方法将该基因沉默后进行基因功能分析。将PsSed5反向基因片段构建到pHAM34的启动子后,同时将其与含有抗遗传霉素(G418)的pTH209载体共转化到大豆疫霉的原生质体中。将PsSed5反向基因片段构建到载体上,选用pHAM34启动子的一段引物作为上游引物,PsSed5基因中靠近5′端的序列作为下游引物,这样就可以扩增出转化子插入片段。在试验中,将只单独转进含有抗性载体pTH209而获得的转化子作为对照(CK)。通过试验可以看到T12、T17和T20都能扩增出目的片段,而野生型菌株和对照菌株没有扩增出目的片段(图2)。进一步提取上述转化子菌丝阶段的RNA,利用实时定量PCR方法筛选沉默的转化子。相比较野生型的受体菌株(WT),对照菌株(CK)的表达量没有显著差异,T12和T17的表达量显著降低,分别为野生型的41%和45%,而另一个转化子T20的表达量与野生型菌株没有差异。因此得到T12和T17 这2个部分沉默的突变体(图3)。

2.4PsSed5沉默突变体表型分析及致病力测定

进一步分析T12和T17 这2个部分沉默的突变体在疫霉生活史的各个阶段表型上的变化。将在含遗传霉素培养基生长的转化子转接活化2代后在V8培养基上观察生长速率,3 d后测量菌落直径,得到的平均值分别为WT:3.8 cm、CK:3.7 cm、T12:2.8 cm、T17:2.9 cm,由此可以发现PsSed5沉默突变体生长速率受到一定的影响。在LBA培养基上生长10 d后,观测有性生殖产生卵孢子的情况,从菌落生长中心接种点附近随机挑取2 cm×2 cm的琼脂块,记录卵孢子个数,随机取3个点,平均值分别为WT:258、CK:267、T12:45、T17:33,这说明PsSed5沉默突变体在有性生殖过程中受到严重影响。为了进一步证实沉默转化子的稳定性,将PsSed5沉默突变体的转化子在不含遗传霉素的V8培养基上连续继代培养10代后,重复上述试验,结果同上面的统计数据趋势相一致。

进一步分析PsSed5沉默突变体在致病性方面的变化。用野生型菌株和PsSed5沉默突变体菌株接种生长10 d的Williams大豆。大豆疫霉在含1%琼脂的V8培养基上培养3 d,在菌落边缘切取2 mm×2 mm的菌丝块作为接种体接种没有创伤的叶片,2 d后发现野生型菌株在大豆叶片上形成明显的扩展,发病显著,而PsSed5沉默突变体菌株几乎没有扩展,说明其丧失了致病性(图4)。同样将继代培养10代的突变体菌株进行上述致病性测定,得到同上述试验相同的结果。

3结论与讨论

细胞内及细胞间的物质交换需要膜泡参与运输,而SNARE蛋白是膜泡间融合的必要因子,SNARE蛋白家族之一的Sed5参与多种运输膜泡之间的融合,其在酵母中是细胞存活所必需的因子之一[4]。在大豆疫霉中,PsSed5基因是组成性高表达,说明其参与了大豆疫霉生长发育及侵染的各个过程,而其沉默突变体表型的变化也证明了该基因在大豆

疫霉菌中起到重要作用。PsSed5沉默突变体的致病性几乎丧失,但考虑到其生长速率有所减慢,菌丝生长势弱,因此不能排除其致病性下降是生长速率减弱所引起的。但近期的研究报道中,真菌一系列和外泌相关基因的功能解析表明,这些基因的缺失会导致一系列致病因子的外泌受到破坏,从而导致致病性的丧失[7]。疫霉属植物病原菌中包含大量的RxLR类外泌效应因子,其中很多被证明在侵染过程中发挥着重要的作用[8] ,因此推测,PsSed5沉默突变体致病性的丧失可能是由于致病因子在外泌过程中被阻断,从而导致大豆疫霉不能成功侵染寄主。在后续研究中,拟通过分析野生型菌株和PsSed5沉默突变体菌株在外泌蛋白的分泌上是否有质和量的差异,以揭示其致病力减弱的主要原因,并找出大豆疫霉菌关键性的致病因子,为大豆疫霉菌的防控提供理论依据。

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