EV71病毒3C蛋白真核表达载体的构建及表达

张华　李兴志　张雅婷

摘要[目的]构建EV71病毒3C蛋白的真核表达载体，并验证其在细胞中的正确表达。[方法]采用RT-PCR技术，从EV71病毒基因组RNA中扩增3C基因，克隆到真核表达载体pcDNA3.0-Flag上，并转染HeLa细胞，通过Western blot和免疫荧光验证3C蛋白的表达。[结果]酶切及测序鉴定显示，EV71病毒3C真核表达载体构建成功。Western blot和免疫荧光结果证实3C蛋白在HeLa细胞中成功表达。[结论]该研究成功构建了真核表达载体pcDNA3.0-Flag-3C，为进一步研究EV71病毒3C蛋白生物学功能奠定了一定基础。

关键词EV71病毒；3C蛋白；基因克隆；载体构建；蛋白表达

中图分类号S188文献标识码

A文章编号0517-6611（2018）08-0097-03

Construction of pcDNA3.0-Flag-3C Plasmid and Its Expression of EV71 3C Protein in HeLa Cells

ZHANG Hua1，2，LI Xingzhi1，2，ZHANG Yating1，2 et al（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing，Heilongjiang 163319；2.Biotechnology Center，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing，Heilongjiang 163319）

Abstract[Objective] To construct the eukaryotic expression vector of EV71 3C protein and investigate its expression in HeLa cells.[Method] Fragment of 3C was amplified from total RNA of EV71 genome and cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.0-Flag.After the recombination vector was transfected into HeLa cells，Western blot and indirect immunofluorescent assay were performed to confirm the 3C protein expression.[Result] Enzyme digestion and sequencing analysis showed that eukaryotic expression vector pcDNA3.0-Flag-3C was constructed correctly.The results of Western blot and indirect immunofluorescent indicated 3C protein was expressed in HeLa cells.[Conclusion] This research successfully constructed eukaryotic expression vector pcDNA3.0-Flag-3C， which might provide the foundation of research about the biological function of EV71 3C protein.

Key wordsEV71 virus； 3C protein； Gene clone； Vector construction；Protein expression

基金项目黑龙江省教育厅科学技术研究面上项目（12541578）。

作者简介张华（1979—），男，湖北荆州人，副教授，博士，从事分子病毒学与免疫学研究。*通讯作者，教授，博士，从事分子病毒免疫与基因工程制药研究。

收稿日期2017-12-07

口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，FMDV）是属于小RNA病毒科的单股正链RNA病毒，FMDV病毒感染会引起偶蹄动物共患的急性、热性、接触性传染病。研究发现，FMDV病毒的致病性与其自身编码的3C蛋白密切相关，其具有帮助病毒自身复制、切割宿主蛋白、诱导细胞凋亡、逃避宿主免疫监视的重要生物学功能[1]。

在前期研究中，发现同属小RNA病毒科的肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）同样具有切割宿主因子[2]，拮抗宿主天然免疫等现象[3]。有报道指出，EV71病毒的3C蛋白在病毒生命周期中發挥举足轻重的作用[4]，而抑制3C蛋白功能可以有效抑制病毒的复制[5]，这些研究提示人们EV71病毒3C蛋白具有发挥类似FMDV病毒3C蛋白功能的可能性，但是诸多小RNA病毒科病毒在感染过程中，3C蛋白是否发挥相同的生物学功能尚不清楚。为了进一步研究小RNA病毒科3C蛋白的功能是否具有普遍相似性，并尝试解析3C蛋白的结构与功能基础，笔者构建了EV71病毒3C蛋白真核表达载体，并进行了表达验证，以期为深入研究FMDV病毒3C蛋白和EV71病毒3C蛋白功能的异同奠定一定的基础。

1材料与方法

1.1材料

HeLa细胞由分子病毒免疫与基因工程制药实验室冻存复苏；鼠单克隆抗Flag抗体和TRITC标记的山羊抗鼠单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术公司；DMEM培养基和胎牛血清（FBS）购自Invitrogen公司；质粒抽提试剂盒购于Omega公司；Trizol试剂和LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；引物合成和序列测定由Invitrogen完成；限制性核酸内切酶BamH I和Hind Ⅲ、逆转录MLV酶和Ex Taq聚合酶购自TaKaRa公司；pcDNA3.0-Flag真核表达载体由分子病毒免疫与基因工程制药实验室保存。

1.2引物设计与载体构建路线

根据NCBI GenBank网站所提供的基因序列（Accession No.：NM_006559），设计扩增EV71病毒3C基因的引物，引物序列为

上游引物：5′-AAGCTTGGGCCCAGCTTAGACTTCGCCTTGT-3′（Hind Ⅲ）；下游引物：5′-GAATTCCTTGCTCGCTGGCAAAATAACTCCTC-3′（BamH I）。

将EV71病毒3C插入pcDNA3.0-Flag质粒的Hind Ⅲ/BamH I位点，构建载体的路线如图1所示。

1.3EV71病毒3C基因的扩增

首先采用Trizol试剂提取EV71病毒基因组RNA，使用MLV酶将RNA逆转录成cDNA，然后使用PCR技术扩增EV71病毒3C目的基因，反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30个反应循环；72 ℃最后延伸5 min，切下目的条带，胶回收，PCR产物测序。反应体系为10×Buffer 5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）4 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板50～500 ng，Ex Taq酶（5 U/μL）0.25 μL，ddH2O补足体系至50 μL，琼脂糖凝胶电泳后切下目的条带进行胶回收。

1.4pcDNA3.0-Flag-3C表达载体的构建

分别用限制性内切酶Hind Ⅲ和BamH I双酶切pcDNA3.0-Flag载体和EV71病毒3C片段。所用酶切体系分别为pcDNA3.0-Flag载体1 μg，Hind Ⅲ 1 μL，BamH I 1 μL，10×M Buffer 1 μL，ddH2O补足体系至10 μL；PCR产物EV71病毒3C 1 μg，Hind Ⅲ 1 μL，BamH I 1 μL，10×M Buffer 1 μL，ddH2O补足体系至10 μL，琼脂糖凝胶电泳后切下目的条带进行胶回收。将胶回收产物16 ℃进行连接，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，并涂布到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，37 ℃培养过夜，挑选克隆。扩大培养后提取质粒DNA，进行PCR和双酶切鉴定及序列测定，鉴定正确的质粒，命名为pcDNA3.0-Flag-3C。

1.5脂质体转染

转染前1 d将HeLa细胞接种至24孔板中，1×105细胞/孔，使细胞达90%～95%汇合度。用50 μL Opti-MEM稀释质粒DNA，轻轻混合，取2 μL LipofectamineTM2000用50 μL Opti-MEM稀释，轻轻混合，室温孵育5 min；将50 μL LipofectamineTM2000混合物加入质粒DNA中，总体积为100 μL，轻轻混合，室温孵育20 min；将100 μL DNA-LipofectamineTM2000混合物加入24孔板中，轻轻混匀，培养6 h后更换培养液，37 ℃孵育，观察24～48 h的转染情况。

1.6Western blot验证质粒转染24～48 h，提取重组质粒pcDNA3.0-Flag-3C转染组的总蛋白。培养细胞用冰预冷的PBS洗2次后加入RIPA裂解液，冰浴5 min，将裂解物12 000 r/min离心10 min后收集上清。在12% SDS-PAGE上分离后，电转移至PVDF膜上。经5%脱脂奶粉封闭2 h后，用小鼠抗Flag克隆抗体室温孵育1 h，再经洗膜，并与相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h，最后经发光反应，并曝光于X光片上，拍照。

1.7间接免疫荧光

细胞爬片，将重组质粒转染至HeLa细胞，24～48 h用4%多聚甲醛固定10 min，0.1% Trixton-100透膜处理20 min，鼠单克隆抗Flag抗体室温孵育1 h，PBS洗涤后，TRITC标记的山羊抗小鼠二抗孵育1 h，PBS清洗后用倒置荧光显微镜进行观察。

2结果与分析

2.1EV71病毒3C的PCR扩增

逆转录病毒基因组RNA成为cDNA，并以总cDNA为模板，PCR扩增EV71病毒3C基因片段，所扩增的PCR产物约为549 bp，与预计大小相同，为所需要的EV71病毒3C片段（图2）。

2.4 Western blot检测在HeLa细胞中表达的重组融合蛋白

利用鼠抗Flag单克隆抗体检测pcDNA3.0-Flag-3C重组载体的表达，结果显示在HeLa细胞中表达的重组载体能特异性结合Flag单克隆抗体，蛋白大小与预期相符（图5）。

3结论与讨论

小RNA病毒科病毒主要包括口蹄疫病毒、鼻病毒、腦心肌炎病毒、肠道病毒，它不仅是感染家畜的重要病原体，而且也是感染人的重要病原体。包括EV71病毒在内的诸多小RNA病毒感染机体后，严重者可导致神经系统的并发症，甚至死亡[6]，小RNA病毒科病毒感染会给国民生命财产安全和畜牧业发展带来巨大的损失，这是不容忽视的。

小RNA病毒科的多种病毒都编码3C蛋白酶，作为小RNA病毒科众多种属中的共同水解蛋白酶，其不仅在剪切病毒蛋白前体、促进病毒复制中起重要作用，而且可以通过抑制抗病毒天然免疫应答，使病毒自身在宿主细胞中大量增殖[7]。脊髓灰质炎病毒和EV71病毒的3C蛋白可以直接裂

解RIG-I，从而抑制RIG-I下游信号[8]。甲型肝炎病毒[9]、

鼻病毒[10]和柯萨奇病毒B组3型[11]的3C蛋白可以通过直接裂解MAVS来抑制I型感染素的产生。FMDV病毒的3C蛋白不仅能够切割宿主蛋白PCBP2，影响宿主蛋白的翻译，而且能够通过阻碍IRF-3/7的活化抑制IFN-α1/β启动子的激活，从而抑制Ⅰ型干扰素的产生[12]。这些研究预示着，3C蛋白酶的研究将会在重大病毒性疾病，如手足口病、口蹄疫、病毒性心肌炎、甲型肝炎、病毒性感冒、病毒性咽峡炎等的攻克方面发挥重要的指导价值。

通过前期对FMDV病毒3C蛋白的研究，提示EV71病毒3C蛋白也可能具有相似的生物学功能。为了进一步比较FMDV病毒3C蛋白和EV71病毒3C蛋白生物学功能的差异，构建了3C蛋白的真核表达载体，并转染HeLa真核细胞，验证其表达情况。转染后的结果显示EV71病毒3C蛋白在细胞内能够正确表达，证明构建和转染都是成功的。在高效表达EV71病毒3C蛋白后，采用倒置荧光显微镜观察红色荧光在HeLa细胞中的分布，结果显示EV71病毒3C蛋白均匀定位在细胞核与细胞质当中。该研究为后续深入研究小RNA病毒3C蛋白的生物学功能奠定了一定的基础。

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