霍山石斛多糖不同组分理化性质及免疫活性的比较研究

王超群 李德文 袁晨琳 罗建平

摘要 [目的]對比研究霍山石斛多糖不同组分的理化性质及对巨噬细胞的免疫调节作用。[方法]采用DEAE阴离子交换层析和Sephadex G-100凝胶色谱层析分离多糖，通过HPGPC、GC、GC-MS和ELISA分析多糖的理化性质和免疫活性，采用主成分分析比较多糖的免疫活性，并结合多元线性回归分析方法，定量分析多糖的构效关系。[结果]霍山石斛多糖包含DHPW-1、DHPW-2、DHPW-3、DHPW-4、DHPW-5、DHPW-6和DHPW-7 7种分子量和均一度各不相同的组分，它们是由葡萄糖、半乳糖和甘露糖以不同的摩尔比按1，4-D-Glcp、1，6-D-Glcp、T-D-Galp、1，4，6-D-Glcp和1，3，6-D-Manp的连接方式所组成，均能不同程度地促进巨噬细胞分泌NO、TNF-α和IL-1β，增强吞噬中性红的能力。[结论]霍山石斛多糖不同组分的理化性质和刺激巨噬细胞的免疫调节活性各不相同，不同连接方式的糖苷键含量和多糖的分子量对它们的免疫活性具有重要影响， 其中DHPW-2与DHPW-4免疫调节活性较好，DHPW-7 的活性最差。

关键词 霍山石斛；多糖；巨噬细胞；免疫调节活性

中图分类号 S567.23+9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）13-0160-05

Comparative Study on Physicochemical Properties and Immunomodulating Activities of Different Components of Dendrobium huoshanense Polysaccharide

WANG Chaoqun1，LI Dewen2，YUAN Chenlin1 et al

（1.School of Food Science and Engineering，Hefei University of Technology，Hefei ，Anhui 230009；2.Anhui Kang Erxin Biological Pharmaceutical Co.，Ltd.，Huaibei，Anhui 235100）

Abstract [Objective]To compare the physicochemical properties of different components of Dendrobium huoshanense and the immunomodulatory effect on macrophages. [Method]The crude polysaccharides of D.huoshanense （DHP） were fractionated by DEAE anionexchange column and gel filtration of Sephadex G100 in turn.High performance gelpermeation chromatography （HPGPC），gas chromatography （GC），gas chromatographymass spectrometry （GCMS） and enzymelinked immunosorbent assay （ELISA） were used to analyze the physicochemical properties and immunomodulatory activities of polysaccharides.The immunomodulating activies of the different fractions of polysaccharides were compared by principal component analysis method，and the quantitative analysis of the structure-activity relationship of the polysaccharides was carried out by combining multiple linear regression analysis. [Result]Seven fractions of polysaccharides including DHPW1，DHPW2，DHPW3，DHPW4，DHPW5，DHPW6 and DHPW7 had different molecular weight and homogeneity.They consisted of glucose，galactose and manose with different molar ratio，glycosidic types including 1，4DGlcp，1，6DGlcp，TDGalp，1，4，6DGlcp and 1，3，6DManp.All the fractions could promote the release of NO，TNFα and IL1β from macrophages，enhance the ability to phagocytose neutral red. [Conclusion]The physicochemical properties of different fractions of DHP and the immunomodulatory activities of stimulating macrophages were different.The content of glycosidic linkages and the molecular weight of polysaccharides of different fractions had important influence on their immunocompetence.DHPW2 and DHPW4 had relatively better immunomodulatory activity while DHPW7 activity were the lowest in the seven fractions from DHP.

Key words Dendrobium huoshanense；Polysaccharide；Macrophage；Immunemodulatory activities

霍山石斛（Dendrobium huoshanense），又称米斛，兰科石斛属多年生草本植物，主产于安徽霍山等地，是一种珍贵的中药材，具有生津益胃、抗白内障、抗肿瘤等功效[1]。多糖是霍山石斛的主要活性成分，近年来有关霍山石斛多糖的提取分离[2-3]、结构鉴定[4]和生物活性研究取得了长足的进展[5]。研究发现，霍山石斛多糖是由多种分子量不同的组分组成，但尚不清楚这些不同组分是否具有相同的理化特性和生物活性[6]。笔者在研究霍山石斛多糖不同组分理化性质的基础上，通过测定小鼠腹腔巨噬细胞对不同组分多糖的免疫调节能力， 同时结合多元线性回归分析法将免疫调节活性和化学结构特征进行关联，探讨它们之间的构效关系，以期为霍山石斛多糖的功能性食品及药品开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 试验所用粗多糖邻苯二甲酸二乙酯（DHP）是从霍山石斛类原球茎中提取获得（霍山石斛类原球茎由合肥工业大学中草药与功能食品研究所提供），转接于MS固体培养基上，在培养温度（25±2）℃、光照时间16 h/d、相对湿度80%条件下培养30 d作为试验材料。SPF级雌性昆明小鼠，购自安徽医科大学实验动物中心，合格证号：皖医实动准9901。

1.2 霍山石斛粗多糖分离纯化

将霍山石斛粗多糖DHP上样于DEAE-Cellulose色谱柱，经水洗收集多糖DHPW， 将DHPW经Sephadex G-100分离，收集各洗脱峰，获得DHPW-1、 DHPW-2、DHPW-3、DHPW-4、DHPW-5、DHPW-6和DHPW-7这7种组分多糖。

1.3 多糖的理化性质分析

多糖的相对分子质量及均一性采用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定，检测器为示差折光检测器。刚果红试验分析多糖的螺旋构象。多糖的单糖组成和甲基化分析分别用气相色谱（GC）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）进行测定，具体操作参照文献[6]的方法。

1.4 多糖的免疫活性测定

根据文献的方法[7]分离纯化小鼠腹腔巨噬细胞，调整细胞浓度为7×106个/mL，置于96孔细胞培养板中培养，每孔加入90或180 μL细胞悬浮液和10或20 μL不同浓度多糖的RPMI 1640溶液（多糖终浓度400、200、100、50、25、10 μg/mL）；空白对照为RPMI 1640，阳性对照为脂多糖（LPS），终浓度为5 μg/mL，每组4个平行。置37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h。培养结束后，4 ℃、1 000 r/min离心10 min取上清培养液，采用中性红法[8]测定巨噬细胞对中性红的吞噬作用，用NO试剂盒按硝酸还原酶法测定NO含量，用ELISA试剂盒测定TNF-α和IL-1β含量，具體方法参照各试剂盒标准操作程序。采用多黏菌素B（PMB）屏蔽LPS的方法[9]，检测PMB预处理后的多糖对腹腔巨噬细胞NO含量的影响，来分析多糖是否被LPS污染。

1.5 不同多糖组分理化性质与免疫活性的关系分析

利用SPSS 17.0进行主成分分析法，对各组分多糖的免疫调节活性进行评价，获得DHPW各组分多糖的综合排名，再在主成分分析的基础上，设置结构特征作为自变量Xi （i=1，2，…，p），多糖的免疫调节活性指标作为因变量，拟合出各组分多糖免疫调节活性与结构特征之间的多元线性回归方程（Y=β0+β1X1+β2X2+…+βPXP+ε），对多糖的构效关系进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 多糖不同组分的理化性质

HPGPC分析显示，7种组分多糖的相对分子量及其多分散系数各不相同（表1）。多糖的均一性在一定程度上与其多分散性系数（d）有关。d=Mw/Mn，d值越接近1，表示均一性越好；d值越偏离1，则均一性越差。在7种组分多糖中，DHPW-3、DHPW-4、DHPW-5、DHPW-6 4个组分d值最接近1，均一性好；DHPW-2、DHPW-7均一性较差；而DHPW-1的d值最高，为杂多糖。单糖组成结果（表1）表明，7种多糖主要由葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）和半乳糖（Gal）这3种单糖组成，但它们的组成比例有所不同。对其他6种多糖来说，DHPW-1的Gal和Man含量较高，而Glc含量较低。DHPW-2、DHPW-3、DHPW-4、DHPW-5、DHPW-6、DHPW-7这6种多糖的Glc含量均高于90%，Man和Gal含量均低于6%，且多糖中Glc含量有逐渐升高的趋势，Man和Gal含量有逐渐降低的趋势，DHPW-7中Glc含量最高，达97.27%，而Man含量最低，仅有1.14%。

当多糖能够与刚果红结合形成络合物，证明它具有螺旋构象，主要表现为与刚果红相比，络合物的最大吸收峰移向长波。从图1可以看出，DHPW-2、DHPW-3、DHPW-4、DHPW-5、DHPW-6和DHPW-7与刚果红相比均无明显的波长迁移，表明不具有螺旋结构，而DHPW-1在NaOH浓度较小时，与刚果红相比紫外吸收有明显的向长波迁移现象，说明DHPW-1能够与刚果红形成络合物，认为DHPW-1具有螺旋构象。随着NaOH浓度升高，DHPW-1最大吸收波长明显下降，推测是高浓度的NaOH导致DHPW-1分子间的氢键被破坏，螺旋构象解体，无法与刚果红形成络合物。

甲基化分析（表2）显示，7种组分多糖的甲基化产物主要为2，3，6-Me3-Glcp、2，3，4-Me3-Glcp，并含有少量的2，3，4，6-Me4-Galp、2，3-Me2-Glcp、2，4-Me2-Manp，它们分别对应1，4-D-Glcp、1，6-D-Glcp、T-D-Galp、1，4，6-D-Glcp、1，3，6-D-Manp糖残基。5种糖残基中，1，4-D-Glcp和1，6-D-Glcp含量最高，T-D-Galp其次，含量最低的为1，3，6-D-Manp，该结果与单糖组成GC分析结果相一致。虽然各组分的糖苷键种类相似，但组成的比例差异明显。其中，DHPW-1的各残基摩尔比与其他6种多糖相比差别最大，其T-D-Galp和1，3，6-D-Manp在7种多糖中含量最高。其他6种多糖中1，4-D-Glcp、1，6-D-Glcp和1，4，6-D-Glcp比例逐渐升高，T-D-Galp和1，3，6-D-Manp比例逐渐降低。DHPW-7中1，4-D-Glcp、1，6-D-Glcp和1，4，6-D-Glcp在7种多糖中含量最高，1-D-Galp和1，3，6-D-Manp含量最低。

2.2 多糖不同组分的免疫活性

植物多糖作用于巨噬细胞可促进细胞系增殖；诱导NO、活性氧簇（ROS）的产生，增强iNOS的活性及表达；促进细胞因子的分泌和相关基因的表达，提高巨噬细胞的吞噬功能[13-16]。由图2可知，7种多糖PMB预处理组与PMB未处理组相比NO浓度无显著差别，同时培养基中的内毒素含量为0.108 7 EU/mL，含量极低，认为7种多糖和培养基均未被LPS污染，对免疫测定结果无影响。图3结果表明，7种多糖在10～200 μg/mL浓度范围内促进巨噬细胞释放NO的表现有所不同，其中DHPW-5对巨噬细胞合成NO的作用呈低剂量促进、高剂量抑制的剂量关系，最佳作用的质量浓度是50 μg/mL，而其余6种多糖对巨噬细胞合成NO的促进作用随着质量浓度的增加而增强，均在200 μg/mL质量浓度条件下表现出最佳的促进作用。与空白对照组相比，DHPW-1～DHPW-7 这7种多糖在各自最有效质量浓度时，巨噬细胞合成NO的能力分别提高了147、1.54、1.28、1.29、1.41、1.36和1.44倍。

TNF-α主要由激活的巨噬细胞所产生，是抗肿瘤免疫反应中的一种重要的细胞因子，也是一种重要的巨噬细胞活性指标[17]。图4显示，7种组分多糖在不同程度上均可促进小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α。在10～200 μg/mL质量浓度范围内，DHPW-1、DHPW-3、DHPW-4、DHPW-5以及DHPW-7这5种组分多糖作用巨噬细胞促进TNF-α分泌的最佳浓度为200 μg/mL，分泌量会随着多糖质量浓度的增加而增加，而DHPW-2和DHPW-6最佳作用浓度为100 μg/mL。与空白对照组相比，DHPW-1～DHPW-7这7种多糖在各自最有效质量浓度时，巨噬细胞分泌TNF-α的能力分别提高了2.11、2.06、1.87、2.00、1.65、1.62和1.43倍。

IL-1β也是由激活的巨噬细胞所产生，在抗肿瘤免疫反应中起重要作用的一种细胞因子[18]。由图5可知，当多糖浓度低于25 μg/mL时，7种多糖均不能促进巨噬细胞分泌IL-1β，随着浓度的升高，DHPW-4表现出较为明显的分泌IL-1β的能力；当多糖浓度达到50 μg/mL时，DHPW-5组的IL-1β浓度与空白组相比也显著升高，但除DHPW-4和DHPW-5外的其他多糖均不能有效地分泌IL-1β；当多糖浓度达到100 μg/mL时，DHPW-1和DHPW-6显示出较强分泌IL-1β的能力，其中DHPW-1组IL-1β浓度相对较低，DHPW-4组IL-1β浓度最高；当多糖浓度达到200 μg/mL时，除DHPW-2和DHPW-3外，其他5种多糖均能够有效地增强巨噬细胞分泌IL-1β的能力，其中仍以DHPW-4的效果最为明显。上述分析表明，在能够有效促进巨噬細胞

分泌IL-1β的DHPW 5种组分多糖中，DHPW-1、DHPW-4、

DHPW-6、DHPW-7 4种多糖促进小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-1β时均显示出较为明显的剂量依赖关系，而DHPW-5在各浓度下均无明显差别。

巨噬细胞作为体内最大的吞噬细胞，是组成天然免疫防线的重要组成部分，因此，巨噬细胞的吞噬能力是评价机体免疫功能的重要指标之一，提高巨噬细胞的吞噬能力对巨噬细胞的免疫功能调节具有极其重要的意义。由图6可知，除DHPW-5外，其他各组多糖对巨噬细胞吞噬能力的影响随着多糖浓度的升高而明显增强，并呈现一定的剂量依赖关系。DHPW-5在10～50 μg/mL浓度范围内随着多糖作用浓度的升高，促巨噬细胞吞噬中性红的能力增强，当浓度达到50 μg/mL时，多糖作用效果达到最大值；当浓度高于50 μg/mL时，多糖对巨噬细胞吞噬活性的促进作用开始下

降，表现出低浓度促进、高浓度抑制的趋势。与空白相比，7

2.3 多糖不同组分理化性质与免疫活性的关系

基于上述巨噬细胞合成NO、分泌TNF-α和IL-1β以及吞噬中性红能力的变化，采用主成分分析法，对DHPW 7种组分的免疫调节活性进行比较发现，主成分1主要与NO和TNF-α含量以及吞噬活性相关，主成分2主要与IL-1β含量相关。从表3可以看出，按照主成分1排名时，7种组分多糖免疫调节活性大小依次是DHPW-2>DHPW-1> DHPW-5>DHPW-4>DHPW-6>DHPW-3>DHPW-7；按主成分2排名时，它们的顺序为DHPW-4>DHPW-3>DHPW-5>DHPW-6>DHPW-1>DHPW-2>DHPW-7。这种主成分排名上显著的差异反映了DHPW各组分对小鼠腹腔巨噬细胞的免疫调节活性各不相同。从综合得分上看，排名第1的多糖为DHPW-2，其次为DHPW-4，DHPW-1排名第3，DHPW-5、DHPW-3和DHPW-6综合得分相差较小，分别排在第4、5、6位。7种多糖中，DHPW-7综合得分最低，表明在7种多糖中DHPW-7对巨噬细胞的免疫调节能力最不理想。

在主成分分析的基础上，以多糖对巨噬细胞的免疫活性的影响值为因变量（Y），以Man、Glc、Gal、Glcp14（1，4-D-

Glcp）、Glcp16（1，6-D-Glcp）、Galp1（T-D-Galp）、Glcp146（1，4，6-D-Glcp）、Manp136（1，3，6-D-Manp）、Mw 9种结种组分多糖在各自最佳质量浓度时，巨噬细胞的吞噬能力相应提高了1.56、1.65、1.49、1.42、1.50、1.42和1.37倍。

构特征指标为自变量（X），采用多元线性回归的方法分析多糖不同组分的免疫调节活性与结构特征之间的关系，得到如下线性回归方程：

由此可推测出，多糖对巨噬细胞NO产量的影响与多糖1，4-D-Glcp和1，3，6-D-Manp含量呈正相关，与T-D-Galp含量及分子量大小呈负相关；诱导巨噬细胞分泌TNF-α的活性与Gal、1，4-D-Glcp含量呈正相关，与1，3，6-D-Manp的含量呈负相关；诱导巨噬细胞分泌IL-1β的活性与多糖的Gal及1，4-D-Glcp的含量呈正相关，与1，4，6-D-Glcp的含量呈负相关；刺激小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的活性与1，4，6-D-Glcp和1，3，6-D-Manp的含量呈正相关，而与分子量大小呈负相关。

3 结论

霍山石斛多糖包含7种分子量和均一度各不相同的组分，它们均由Glc、Man和Gal 3种单糖以1，4-D-Glcp、1，6-D-Glcp、T-D-Galp、1，4，6-D-Glcp、1，3，6-D-Manp连接方式所组成，但各单糖及连接的糖苷键类型的组成比例不同。不同组分多糖对小鼠腹腔巨噬细胞的免疫功能均具有一定的调节作用，主成分分析表明，DHPW-2效果最好，DHPW-4次之，DHPW-1排名第3，DHPW-7的免疫调节作用一般。多元线性回归分析结果表明，不同连接方式的糖苷键含量和多糖的分子量对它们的免疫活性具有重要影响。

参考文献

[1]

包雪声，顺庆生，陈立钻.中国药用石斛[M].上海：复旦大学出版社，2001.

[2] 秦霞，董海丽，刘红.响应面法优化霍山石斛多糖超声提取工艺[J].安徽农业科学，2012，40（12）：7065-7066.

[3] 黄森，查学强，罗建平，等.Box-Behnken 法优化提取霍山石斛活性多糖的研究[J].中药材，2007，30（5）：591-594.

[4] LI F，CUI S H，ZHA X Q，et al.Structure and bioactivity of a polysaccharide extracted from protocormlike bodies of Dendrobium huoshanense[J].International journal of biological macromolecules，2015，72：664-672.

[5] 查学强.濒危名贵药用霍山石斛类原球茎液体培养生产活性多糖的研究[D].合肥：合肥工业大学，2006.

[6] 袁晨琳.霍山石斛多糖对巨噬细胞的免疫调节活性及其与结构特征的关系[D].合肥：合肥工业大学，2013.

[7] ZHA X Q，LUO J P，LUO S Z，et al.Structure identification of a new immunostimulating polysaccharide from the stems of Dendrobium huoshanense[J].Carbohydrate polymers，2007，69（1）：86-93.

[8] YEH C H，CHEN H C，YANG J J，et al.Polysaccharides PSG and protein LZ8 from Reishi （Ganoderma lucidum） exhibit diverse functions in regulating murine macrophages and T lymphocytes[J].Journal of agricultural and food chemistry，2010，58（15）：8535-8544.

[9] 田维毅，王文佳，李海峰，等.中性红法检测巨噬细胞吞噬功能的实验条件的优化[J].贵阳中医学院学报，2009，31（2）：23-26.

[10] LEE K Y，JEON Y J.Macrophage activation by polysaccharide isolated from Astragalus membranaceus[J].International immunopharmacology，2005，5（7/8）：1225-1233.

[11] 楊兴斌，梅其炳，周四元，等.当归多糖对小鼠腹腔巨噬细胞释放细胞效应分子的诱导作用[J].细胞与分子免疫学杂志，2004，20（6）：747-749.

[12] 姚金凤，王志新，张晓勇，等.黄芪多糖对小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能的调节作用研究[J].河南大学学报（医学版），2005，24（1）：34-36.

[13] CHOI E M，HWANG J K.Enhancement of oxidative response and cytokine production by yam mucopolysaccharide in murine peritoneal macrophage[J].Fitoterapia，2002，73（7）：629-637.

[14] SONG J Y，HAN S K，SON E H，et al.Induction of secretory and tumoricidal activities in peritoneal macrophages by ginsan[J].International immunopharmacology，2002，2（7）：857-865.

[15] TEDGUI A，MALLAT Z.Cytokines in atherosclerosis：Pathogenic and regulatory pathways[J].Physiological reviews，2006，86（2）：515-581.

[16] 石榴.RNAi沉默NF-κB p65对小鼠巨噬细胞表达细胞因子的影响[D].广州：南方医科大学，2009：30-31.