动物肌肉发育相关印记基因研究进展

贺花 何帆 黄永震 姜艳芬 郭抗抗 王晶钰 张彦明

摘要 就印记基因的发展过程、主要特点及作用机制进行了简要概述，并主要介绍了与肌肉的生长发育密切相关的部分印记基因（DLK1、SNRPN、IGF2和H19），印记基因的作用原理以及对肌肉发育的影响。

关键词 动物；肌肉发育；印记基因；甲基化

中图分类号 S813 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）27-0029-03

Research Progress on Imprinted Gene Related to Development of Animal Muscle

HE Hua1， HE Fan2， HUANG Yongzhen3 et al

（1. College of Veterinary Medicine， Northwest Agriculture and Forestry University，Yangling， Shaanxi 712100；2. College of Food Science and Engeneering， Northwest Agriculture and Forestry University，Yangling， Shaanxi 712100；3. College of Animal Science and Technology， Northwest Agriculture and Forestry University，Yangling， Shaanxi 712100）

Abstract Discovery process， main features and mechanism of action of imprinted genes were summarized.Part of imprinted genes （DLK1，SNRPN，IGF2 and H19） which was associated with the growth and development of animal muscle was introduced. Working principles and its influences to muscles were described.

Key words Animal；Muscle development；Imprinted gene；Methylation

基金項目 国家自然科学基金青年科学基金项目（31601926）；中国博士后科学基金面上项目（2015M570856）；陕西省博士后科研项目资助基金（2016BSHYDZZ44）；陕西省自然科学基础研究计划一般项目（面上）（2017JM3012）；西北农林科技大学2017年大学生创新创业训练计划（S201710712086）。

作者简介 贺花（1985—），女，陕西咸阳人，实验师，博士，从事本科教学实验室管理和动物性食品卫生检验相关研究。

*与第一作者具有同等的贡献。

收稿日期 2018-05-31；修回日期 2018-06-15

随着科学研究的发展与进步，科学家们逐渐意识到并发现了隐藏在人类基因中的一种特殊的基因，即印记基因。研究表明，来自亲本双方的两个等位基因，在遗传过程中进行了修饰作用，造成了子代中一个基因表达而另一个基因不表达或表达不显著的现象，这一现象被叫做基因组印记（Genomic Imprinting）。其中，父（母）源印记指的是来自父（母）方等位基因不表达者，能产生印记效应的单等位表达基因称为印记基因（Imprinted Genes）。目前对发现的少数印记基因的研究表明，印记基因功能强大且作用很广泛，该发现对现代医学与生物学都做出了较大贡献。其中，在动物肌肉生长发育的调控因素的研究中，也发现了印记基因的关键作用，引发了科学家在此领域的探索。

1 印记基因的发现及其特点

1.1 印记基因的发现

历史上关于印记基因现象的最早报道出现于1960年，Crouse[1]在Sciara昆虫（属尖眼蕈蚊科尖眼蕈蚊属，是一种双翅目的小型昆虫，分布范围广，食物来源繁杂，通常繁殖并生存在畜粪丰富、垃圾多、潮湿及腐殖质丰富的地方）的X染色体中发现，等位基因中来自于父方的基因不能正常表达发挥作用，反而只有来自于母方的基因可以正常表达。在此之后，于20世纪80年代，科学家在对小鼠的细胞进行核移植的试验时，发现了位于哺乳动物体内染色体上的印记基因。1984年，Barton等[2]发现，当2个细胞核来自同一个个体时，其只能在初期发育，到发育后期就会死亡；而只有当2个细胞核来自2个不同个体时，就得以正常存活并继续生长发育。根据现在已有的科学研究得知，同一来源的2个细胞核组成的个体之所以会在早期发育而后期死亡，是由某些印记基因的作用引起的。继而于20世纪90年代初，有3个试验室分别在对小鼠的试验中发现了3种具有重要意义的印记基因，分别是：父源印记基因IGF2、母源印记基因IGF2R和H19。这一发现是印记基因的研究历史上的里程碑式的进步[3-5]。

大量研究表明，印记基因主要存在于4类物种中，分别是真兽类哺乳动物、有袋类动物、种子植物和人类。2000年，Koski等[6]发现鸡的IGF2基因在其胚胎发育期间表现出印记现象，同年O Neill等[7]报道称IGF2基因在鸡的胚胎发育期是父源和母源的2个等位基因在同时表达，而鸡的M6 P/IGF2也没有出现印记现象。而有关鸟类的印记基因的研究则出现了一些矛盾的现象，因此不能明确其是否真的具有印记基因。通常情况下认为鱼类、爬行类和两栖类（部分鲨鱼也是有胎盘的）等是不含有印记基因的。

1.2 印记基因的特点

印记基因的特点主要是以下几个方面：（1）根据亲本来源，在来自父方与母方的等位基因中，仅有一方的等位基因会表达，以使来自两方的基因组表达而表现不同的功能；（2）富含CpG岛（CpG是胞嘧啶C-磷酸 p-鸟嘌呤 G的缩写，常出现在真核生物编码基因的调控区），十分容易被高度甲基化修饰，表明在印记状态的维持上，甲基化修饰发挥着重要的作用；（3）在DNA基因组上，印记基因很少单独存在，而往往是多个相连着出现，这表明印记基因相互之间存在着某种共线性的作用，因此多个印记基因的区域才会相连出现[8]；（4）印记基因具有印记遗传的组织特异性，具体来说，在遗传印记的过程中，相同的一对等位基因只在特定的个体部位表现印记效应，即只表达父源或者母源一方的等位基因，而在另外的组织器官等，两者都会表达，不显示印记效应[9]；（5）目前关于印记基因的研究，大部分出现于小鼠或者人类，可见印记基因具有物种间的保守性[9]；（6）存在包括H19基因在内的少量印记基因，它们不会最终翻译生成蛋白质，但是转录生成RNA的过程却会发生[9]；（7）约有15%的印记基因的反义链是可以通过转录生成RNA的，并且这些RNA的生成也属于遗传印记，且是父方等位基因的表达，但不包括Tsix（Xist的反义序列，Xist即X- inactive specific transcript，失活X染色体特定转录，Tsix为Xist的负向调节因子），其它多数印记基因的反义链都只转录不翻译[9]。（8）在DNA的复制过程中，印记基因具有复制时可以不同时发生的特性[10]。

2 印记基因的印记机制

哺乳动物印记基因的印记过程，一般大致可以分为3个部分，分别是印记的形成、印记的维持与印记的去除。在哺乳动物成熟的配子中，印记已经形成，而且印记将持续存在直到出生以后。有一点值得说明的是，在卵母细胞的核移植试验中，科学家发现，当对应DNA被甲基化修饰后，才可以获得基因印记，反之则不能获得。而前文中也有提到过，对于印记基因的维持来说，甲基化是一个必要的因素。基因印记的去除发生在原始生殖细胞的早期阶段，而这个阶段中的印记基因的甲基化修饰还在继续维持。而在染色体复制时，甲基化修饰无法继续维持，因此，母方的去甲基化过程是被动进行的。在囊胚阶段时，甲基化修饰会在内细胞团中重新进行。在受精时及受精后，甲基化修饰过的等位基因将继续其甲基化状态，没有被甲基化修饰过的等位基因将继续其非甲基化的状态。在囊胚期，遗传印记将建立。而在胚胎期之后，遗传印记仅出现于各组织器官，原始生殖细胞中的基因印记将被清除。

3 印记基因的调节机制

3.1 启动子修饰模式

印记基因的启动子中含有大量的鸟嘌呤和胞嘧啶，而且其往往在此中的某个等位基因中是高度甲基化的。该过程后，启动子无法和转录因子结合，从而抑制该等位基因转录，继而抑制基因的表达。甲基化CpG结合蛋白2（Methyl CpG binding Protein 2，MeCP2）、组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase，HDAC）等构成复合体，在组蛋白H4上，发生去乙酰化修饰这一过程，最终使得染色体发生紧缩，从而基因转录生成RNA被抑制[10]。

3.2 边界元件的作用模式

顺式阻遏效应是许多印记基因差异甲基化区域（Differentially Methylated Region，DMR）经过甲基化修饰后所具有的，通过甲基化修饰作用，个体自身的等位基因就不能够继续表达，失去了活性。但也有另一种作用效果，对于部分印记基因DMR来说，甲基化修饰会活化自身等位基因从而进行正常的表达作用。这一诱导作用主要通过隔离蛋白与边界元件之间的作用来进行。例如，隔离蛋白CTCF因子是边界元件CCCTC序列的基因特异性结合因子。在交互印记IGF2/H19中，印记中心（Imprinting Center，IC）是一段长约2 kb的DNA片段，位于IGF2和H19之间。在父方表达的等位基因中，通过甲基化修饰IC，由于CTCF因子不再能够与其正常结合，因而使增强子优先作用于IGF2基因，于是H19基因被抑制正常作用，IGF2基因开始表达。相反，在母方表达的等位基因中，由于IC没有被甲基化修饰，不影响CTCF因子与之正常结合，因此IGF2基因被抑制转录，而在H19基因的启动子上增强子发挥作用，H19基因能够正常表达[10]。

4 与动物肌肉发育相关的印记基因作用机制及其研究进展

4.1 DLK1

DLK1（Delta-like 1 Homologue）是目前已知的印記基因中的其中一种，它表现为父源等位基因表达而母源等位基因沉默[11]。研究表明，它参与了多种细胞的增殖、分化调节的过程，发挥不可忽视的作用[12]。DLK1属于表皮生长因子的一种。DLK1与GTL2（Gene Traped Locus 2）是一对印记基因，人的DLK1基因全长1 557 bp，编码序列中含有1 152个核苷酸，编码383个氨基酸残基[13]。

在DLK1与GTL2这对印记基因中，DLK1是父源表达，母源沉默的印记基因（此基因在人、羊、鼠中高度同源）；而GTL2印记基因是仅有母源表达的。DLK1印记基因定位于人的14号染色体、小鼠的12号染色体以及绵羊的18号染色体[13]。在人14号染色体上，目前已知DKL1印记基因有3个DMR区域，分别是DKL1基因3端的DMR区域，位于GTL2基因上游15 Kb的基因间差异甲基化区以及包括了GTL2基因的启动子和第一外显子的DMR区域[14]。这些甲基化区域调控着该基因印记的表达，决定了一对等位基因是由父源表达还是由母源表达。例如，位于小鼠12号染色体上的DKL1基因表达的是父源等位基因，由该基因编码合成是一种跨膜糖蛋白，与Delta/Notch信号转导有关，能够维持细胞的正常分化和增殖[15]。经研究发现，DLK1基因的作用机制与GTL2基因是紧密联系的，与位于小鼠7号染色体上的印记基因组IGF2/H19作用机制十分相似[10]。DLK1和IGF2基因同样都是在去甲基化修饰过程后，表达作用被抑制，从而间接地促进了GTL2基因和H19基因的表达[13]。

研究表明，DLK1基因能够调节肌细胞和人骨骼肌干细胞的分化，并且在胎盘类哺乳动物的生长发育过程中，对肌肉的发育有促进作用，而抑制脂肪组织的生长[16-17]。

4.2 SNRPN

SNRPN（encode Small Nuclear Ribonucleoprotein Polypeptide N）基因是编码小核核糖核蛋白多肽N的印记基因，其作用是与前体RNA结合，从而影响RNA的选择性剪接[18]。SNRPN基因在鼠和人中均为父源等位基因表达[19-20]，其在鼠的肺、肝、脾、肾、子宫、睾丸和脑等组织器官中都有表达，但在脑中表达量最高[21]。另一研究发现，仔猪的SNRPN基因在心脏、肌肉中的表达量均低于其他组织，心脏中的表达量较低这一现象在啮齿类动物中可能存在着种间差异[22]。人的SNRPN基因定位于染色体15 q11-q13的PWS/AS区域[18]，Glenn等[23]通过Northern Blot试验发现SNRPN在脑的不同部位都高表达，包括下丘脑，这表明SNRPN基因在下丘脑中极有可能发挥了重要的不可替代的作用。在对人和鼠中的研究试验中发现，该印记基因异常表达时是会影响到个体神经系统的发育进程的。同时相关研究表明，在猪中该基因在神经系统中高度表达，这说明该基因对神经系统的发育有着重要影响和作用[22]，而到个体成年时，其各组织器官中该基因的表达达到了相对稳定，只有在心脏、骨骼肌中的表达量是略微低于其他组织器官中的表达量的[24]。同时，研究发现SNRPN基因在猪的各个时期的胎盘中都能够稳定表达，没有大的起伏和变动，这可能与SNRPN基因的功能有一定关系[22]。还有研究表明该基因同时与细胞的分化、细胞的增殖、胚胎的发育以及一些精神行为等有关联[25-28]。由此可见，SNRPN基因不仅在胎盘功能和仔猪生长发育过程中发挥着重要的作用，而且在肌肉的生长发育过程中也起到了重要作用。

同样在下丘脑中高度表达的还有NDN（Necdin）基因和UBE3A（Ubiquitin-protein ligase E3A）基因，虽然在肌肉中表达量较低，但也发挥了作用，促进生长[22]。

4.3 IGF2和H19

IGF2（Insulin-like Growth Factor 2）基因是胰岛素样生长因子之一，主要在胎儿的发育时期、肿瘤细胞的增殖分化时期以及肌肉的生长方面发挥重要的调节作用。由于IGF2基因与肌肉的生长密切相关，因此该基因是影响猪胴体瘦肉率和背膘厚度的基因中重要的候选基因之一[29]，与之相关的试验也进一步说明了IGF2基因对肌肉生长的关键影响。研究表明，15～23周龄的公猪，其IGF2基因印记浓度与背膘厚度呈负相关，说明IGF2基因对于脂肪组织的积累有反向调节作用[30]。1986年，Florini等[31]提出了IGF2基因的作用方式是通过对浓度的控制达到促进肌纤维的增殖和分化的目的。

H19基因位于IGF2基因的下游，只转录RNA，而不翻译形成蛋白质，是母源表达、父源沉默的印记基因，H19基因是以转录形成RNA的形式来发挥功能和作用的，一般认为H19基因参与了IGF2基因的表达调控[32-34]。研究发现，H19和IGF2基因是一对相互影响的印记基因组。在H19基因作用时，其抑制了母源染色体的转录过程，从而降低了IGF2印记的浓度[29]。

通过对瘦肉型品种长白猪和脂肪型品种蓝塘猪的研究，可得知IGF2基因和H19基因在猪脂肪沉积和生长发育上发挥了重要作用和影响，同时发现其在猪早期的肌肉等组织的生长发育过程中起到了重要作用，证实了IGF2基因和H19基因与动物肌肉生长发育密切相关，从而发挥关键性作用[28-29]。

5 印记基因应用前景

尽管印记基因的数量只占人体基因总数的很小的比例，但它们的表达会对个体的整个生长发育过程都有着重要影响，由此来看，印记基因的作用研究无疑将会是未来研究的重点。相信在生命科学技术日益发展和完善的今天，印记基因的研究与应用将成为科学家们的又一热门研究领域。除了生长发育，如果能在成体组织中对印记基因功能进行更深入的分析，或许将有助于了解动物遗传疾病、肿瘤等的发病机理，并使这些疾病能够得到一定的解决或改善。

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