营养因素影响蜜蜂级型分化的研究进展

郑素梅 罗娟 高玉人 万萍

摘要从营养元素方面综述蜜蜂级型分化的研究进展，介绍蜂王浆中10-HDA、Royalactin，蜂粮中相关MicroRNA对蜜蜂级型分化的影响，并展望今后蜜蜂级型分化分子机制的研究方向。

关键词蜜蜂；级型分化；MicroRNA

中图分类号S89文献标识码A文章编号0517-6611（2018）05-0025-03

AbstractThe research progress of caste differentiation of honey bee was reviewed from the aspects of nutritional factors，the effects of 10HDA and Royalactin in royal jelly and related MicroRNA in bee bread on caste differentiation of honey bee were introduced. The research direction of caste differentiation mechanism of honey bee was also prospected.

Key wordsHoney bee；Caste differentiation；MicroRNA

典型的蜂群是由蜂王、工蜂和雄蜂2種性别3种类型的蜜蜂群体组成，其中雌性蜜蜂分化出蜂王和工蜂2种级型[1]。蜂王的个体比较大，性器官发育完全，专门负责产卵生殖，繁衍后代；工蜂个体比较小，是生殖器发育不完全的雌蜂，专门负责建筑巢室、采集食料、哺育幼虫、清理巢室以及调节巢湿等[2-3]。蜜蜂是一种经济昆虫，同时作为社会生物学研究的模式生物，是一种高度真社会性昆虫，生殖劳动分工在社会性昆虫当中存在着极重要的进化意义，而其基础是级型分化。

级型分化是指在社会性昆虫群体中，相同性别的个体在形态结构、生理状态和行为方式上存在显著差异的现象。级型分化对于蜜蜂生物学的研究有着举足轻重的意义，具体是指雌性蜜蜂幼虫分化成生殖个体和非生殖个体——既可发育成为可育的蜂王个体，也可发育成为不可育的工蜂个体的现象。蜜蜂级型分化的关键时期是3～5日龄，1～3日龄所有的幼虫喂养蜂王浆，大于4日龄雌性幼虫喂养由花粉和蜂蜜调制的蜂粮，发育成为工蜂，只有蜂王房里的幼虫始终喂养蜂王浆发育完全成为蜂王[4]。蜂王和工蜂两者都是由受精卵发育而来的雌性蜜蜂，具有相同遗传物质的蜜蜂幼虫在表型上存在巨大差异的关键环境决定因素在于差异性饲喂[5]。喂养蜂王浆的幼虫发育成蜂王，喂养蜂粮的幼虫发育成工蜂。

雌性蜜蜂级型分化现象是最典型的表观遗传现象之一。近年来，关于蜜蜂级型分化的研究已经取得了诸多重要进展[6-7]。长期以来，就营养对蜜蜂级型分化的研究主要集中在蜂王浆这一块，但近期也有关于蜂粮对蜜蜂级型分化的影响研究。笔者综合前人研究，主要从蜂王浆和蜂粮这两个营养因素方面，综述营养差异对雌性蜜蜂幼虫级型分化产生的影响（图1）。

1蜂王浆中相关物质的促进作用

蜂王浆的成分相对比较复杂，包括水、蛋白质、脂肪酸、游离氨基酸、糖类、维生素和矿物质等，它是蜜蜂巢中培育幼虫的青年工蜂咽下腺和上颚腺分泌的乳浆状物质，其中蛋白质和糖类是蜂王浆的主要成分[8-9]，普遍认为是蜂王浆刺激蜜蜂幼虫分化成蜂王。

1.110-HDA是蜜蜂级型分化的主要活性因子

2011年，Spannhoff等[10]在《EMBO》杂志在线发表一项研究成果，研究表明蜜蜂幼虫发育成为蜂王这一表观遗传现象可部分归因于蜂王浆比蜂粮含有更高的组蛋白脱乙酰酶抑制剂（HDACi）活性。10-羟基-2-癸烯酸（10-hydroxy-2-decanoic acid，10-HDA，王浆酸）是蜂王浆的主要成分之一，具有组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）活性。10-HDA 能够抑制组蛋白去乙酰化酶（HDACs）的活性，从而使组蛋白乙酰化水平增加。组蛋白尾部氨基酸残基的乙酰化能松弛染色质结构，增加转录因子对靶基因的可访问性[11]。因此，组蛋白乙酰化水平的增加通常与基因表达的激活相联系。HDACi能够诱导细胞周期素依赖的蛋白激酶抑制因子p21，p21蛋白的主要功能是阻滞细胞的生长[12-14]。在蜜蜂幼虫的发育过程中，10-HDA可能通过增加p21基因的表达量，抑制细胞生长，从而影响蜜蜂的生长发育。

此外，DNA甲基化水平与蜜蜂级型分化息息相关，相关研究表明，DNMT3（DNA甲基转移酶）表达沉默，能够使蜜蜂幼虫的发育方向从工蜂转向蜂王[15-16]。应用荧光定量 RT-PCR 技术分析发现3日龄幼虫DNMT3基因表达水平与组蛋白去乙酰化酶4基因（HDAC4）的表达谱极为相似，都会随着10-HDA 浓度的增加先显著降低后又显著升高，组蛋白去乙酰化酶4（HDAC4）的活性对DNMT3基因的表达有重要的影响，继而调控蜜蜂幼虫的级型分化。

1.2Royalactin是蜜蜂级型分化的重要调控因子

蜂王浆的研究是蜂学领域的一个热点，人们发现蜂王浆诸多生物学功能都是由主要王浆蛋白（major royal jelly proteins，MRJPs）产生的。MRJPs是一个比较大的蛋白家族，迄今为止已经有9个家族成员被发现，分别命名为MRJP1、MRJP2、MRJP3、MRJP4、MRJP5s、MRJP6、MRJP7、MRJP8和MRJP9，含量最高的MRJP1（57 kDa蛋白）占水溶性蛋白的48%[17]。目前，有报道证明，蜂王浆中的Royalactin蛋白（也称为MRJP1）是西方蜜蜂级型分化的关键因子，而蜂粮中Royalactin蛋白含量相对较低。

Kamakura[18]在新鲜的蜂王浆中发现了一种被称为Royalactin（MRJP1）的蛋白质，这种蛋白质能够促进生长激素的分泌，进而调控一系列基因的表达，使幼虫出现体型变大、卵巢发达等蜂王的特征，但是它不稳定，在保存过程中会降解。Kamakura进行了试验比对，分别喂养蜜蜂幼虫新鲜的蜂王浆以及存放30 d的蜂王浆，研究发现只有喂养新鲜蜂王浆的蜜蜂幼虫最后分化成为蜂王。然而，在贮存30 d的蜂王浆中加入Royalactin后，发现其能够诱导蜜蜂幼虫分化成为蜂王。进一步研究发现，Royalactin可以通过脂肪体中的表皮生长因子受体（Egfr）激活P70 S6激酶，这种激酶对幼虫体型变大有重要作用，能够增加细胞分裂素活化蛋白激酶的活性，提高卵巢管发育必需的保幼激素水平，促进蜜蜂幼虫卵巢的发育，该激素在幼虫发育期间的第五日龄决定幼虫向着蜂王方向发育。Royalactin通过脂肪体中的Egfr信号通路激活MAPK，引起蜕皮激素水平的上升，从而缩短蜜蜂幼虫发育的时间，保幼激素和蜕皮激素两者共同协作并调控蜜蜂幼虫的级型分化。

2蜂粮中相关MicoRNA的调控作用

MicroRNA（miRNA）的长度为20～24个核苷酸，是一类内生的非编码单链RNA分子，在动植物中参与转录后基因表达调控，能通过抑制mRNA翻译或者降解mRNA在转录后水平对基因表达产生负调控作用；在特定情况下，还有可能进行翻译激活从而正向调控基因的表达[19]。miRNA是表观遗传学主要研究方向之一。从理论上来说，蜜蜂作为一种高度社会化的昆虫，其复杂的社会行为随着基因表达的改变而受到调控，miRNA很有可能参与其中。

蜂粮是以花粉为原料，添加蜜蜂的分泌物并经蜜蜂调制加工，经微生物发酵而成。蜂王浆是青年工蜂食用花粉之后分泌的乳白色或者淡黄色的乳状物，是其咽头腺的分泌物，其中蛋白质和糖类是蜂王浆的主要成分。研究蜂王浆、蜂粮、花粉以及蜂蜜中的成分，发现蜂王浆里99.9%的miRNA都是动物源的。在蜂粮和花粉中发现了大量植物源的miRNA。Behura等[20]用荧光定量PCR的方法对20个miRNA在幼龄哺育蜂和老龄采集蜂大脑中的表达差异进行了比较。发现其中miRNA-124、miRNA-14、miRNA-276、miRNA-13b、let-7和miRNA-13a在幼龄哺育蜂的大脑中高度表达；miRNA-12、miRNA-9、miRNA-219、miRNA-210、miRNA-263、miRNA-92和miRNA-283在老龄采集蜂的大脑中高度表达。该研究说明，蜜蜂基于日龄发生行为的改变中可能有miRNA的参与。有相关研究发现食物中的miRNA能够被吸收，而且吸收以后能够被送到相关的组织和器官中去，跨界调控动物的基因，产生生物学作用[21-24]。

2.1相关植物miRNA对蜜蜂级型分化的影响

蜂粮和蜂王浆有一个最大的区别，即前者存在大量的植物miRNA。研究发现在蜂粮和花粉中可以利用qRT-PCR检测到16种有代表性的植物miRNA（mir156a、mir157a、mir158a、mir160a、mir162a、mir166a、mir166g、Sly-miR167a、mir168a、mir172a、miR172c、mir390a、mir397a、mir403、miR824和mir845a），但在蜂王浆和蜂蜜中无法检测到。

雌性蜜蜂幼虫终身食用蜂王浆变成蜂王。然而，Zhu等[25]在蜂王浆中添加天然含量的人工合成的16种有代表性的植物miRNA，与对照组相比，发现添加植物miRNA组别中的蜜蜂幼虫的表型更加倾向于工蜂，发育缓慢，体型变小、不育。将食物中的植物miRNA剔除之后再喂养，发现幼虫趋向蜂王生长。该研究说明蜂粮中存在的植物miRNA或许通过抑制蜜蜂幼虫发育以及级型分化的信号通路，继而抑制了蜜蜂幼虫的卵巢、体重以及整体发育，从而分化成为工蜂。这一结果在果蝇身上也得到了验证。

2.2相关植物miRNA在蜜蜂级型分化信号通路中的调控作用

参与蜜蜂级型分化的信号通路有胰岛素信号通路（IIS）、MAPK和S6K信号通路、蛋白激酶TOR信号通路等。TOR是真核生物中高度保守的一种大分子的Ser/Thr激酶，是免疫抑制剂雷帕霉素在体内的靶物质，能对营养以及生长因子等因素的变化做出应答反应，在细胞生长增殖过程中发挥中枢作用[26]。已有研究证明蜜蜂TOR（Apis mellifera TOR，amTOR）在幼虫级型分化中具有促进作用：amTOR活性升高与蜜蜂幼虫发育成蜂王息息相关，而降低amTOR活性将决定着蜜蜂幼虫朝着工蜂的方向发展[27-28]。

2017年Zhu等[25]通过RNAhybrid和miRanda算法预测共有96个蜜蜂基因作为16种有代表性植物miRNA的靶基因。预测的96个基因中，大多数都只是一种植物miRNA的靶基因，而少数基因是2～3个miRNAs的共同靶基因。荧光素酶报告基因测定试验表明miR162a特异性作用于amTOR并介导该基因的转录后抑制。

为了确定miR162a能单独影响amTOR的表达，利用合成的miR162a或对照RNA喂养蜜蜂幼虫。与喂养对照RNA的蜜蜂幼虫相比，喂养miR162a食料的蜜蜂miR162a摄入量显著增加以及amTOR mRNA水平降低。同样，在喂养花粉总RNA或miRNAs（含16种代表性miRNA）的蜜蜂中，amTOR mRNA水平被下调。与对任何测试形态特征无影响的对照RNA不同，在食物中加入miR162a的蜜蜂幼虫羽化后体重显著减轻，体型以及卵巢变小，更加趋近于工蜂的表型[25]。

3小结

蜜蜂是一种经济昆虫，全球蜂群产生蜂产品的经济效应不可估量，蜜蜂授粉所引发的经济效应以及生态效应更是一个庞大的数字。蜜蜂幼虫级型分化一向是蜜蜂生物学的

研究热点，对于雌性蜜蜂级型分化的研究，不仅可以有效地丰富蜜蜂的生物学理论，而且对于加快蜂群的繁殖，迅速培育强群打下非常坚实的基础，为广大养蜂群体以及养蜂业贡献有效的力量。蜂王和工蜂都是由受精卵发育而来的，两者具有相同的遗传物质，

但是在形态结构、行为和生理特征上存在明显的差异，诸多研究表明这种差异主要是幼虫时期的营养组分所造成的。研究蜜蜂幼虫的主要食物来源——蜂王浆和蜂粮中各种活性组分的生物学功能对于解开工蜂和蜂王级型分化的谜团是一个非常关键的因素。但是，到目前为止，对于蜜蜂幼虫食物中对级型分化起作用的相关组分的識别尚未终结，依然存在着未知领域，仍然需要进行深入研究。因此，蜜蜂对于表观遗传学的研究具有非常高的模型价值。对于影响蜜蜂级型分化的主要活性物质，研究人员做了大量工作，目前已发现蜂王浆中存在大量的10-HAD和Royalactin蛋白，其在蜜蜂级型分化中起关键作用[29]。近来的研究发现蜂粮中植物源的miRNA含量同样也对工蜂的分化起着非常重要的作用。随着新生物技术的发展以及新领域的开拓，影响蜜蜂幼虫级型分化的活性物质和相关调控机制的研究逐渐丰富，可为哺乳动物表观遗传学的研究提供更多理论基础。

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