烤烟不同生长发育时期叶片保水力变化特征

许志文 张小全 胡育玮 魏星 张鋆鋆 郭传滨 杨立均 夏宗良

摘 要：为探明烤烟不同生长发育时期叶片保水力变化特征，以抗旱性不同的3个烤烟品种移栽后10、30、50和70 d的离体叶片为材料，研究了不同发育时期叶片保水力、叶片失水24 h前后抗氧化酶活性、激素和抗逆胁迫响应基因表达的变化特征。结果表明，品种、发育时期以及两者互作对叶片保水力的贡献率分别为63.09%、24.65%、12.25%，3因素均对烤烟叶片保水力有极显著的影响。3个品种的叶片保水力表现为植株发育后期相对较高，同一发育时期为豫烟6号最高，ND202最低。叶片失水后抗氧化酶活性（SOD、POD、CAT）均表现升高，其中以豫烟6号增幅最大，SOD与POD活性在植株发育后期增幅较大；MDA含量与相对电导率增幅为豫烟6号最小，各品种在植株發育后期增幅较小；叶片失水后ABA含量升高，IAA含量略有降低，烤烟发育后期IAA、CTK和GA含量明显降低；叶片失水后胁迫响应基因（AREB、CDPK2、LEA5、ERD10C）表达量显著升高，以豫烟6号增幅最大，各时期增幅均表现出豫烟6号>K326>ND202，与品种间叶片保水力趋势相一致。本试验说明品种的遗传因素是影响烤烟叶片保水力的关键因素，各时期均可采用叶片保水力进行抗旱鉴定。

关键词：叶片保水力；生长发育时期；品种因素；胁迫响应基因

中图分类号：S572.01 文章编号：1007-5119（2018）02-0017-08 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.02.003

Characteristics of Leaf Water Retention Capacity in Flue-cured Tobacco at Different Growth Stages

XU Zhiwen1， ZHANG Xiaoquan1*， HU Yuwei1， WEI Xing1， ZHANG Yunyun1， GUO Chuanbin2，

YANG Lijun2， XIA Zongliang3

（1. College of Tobacco Sciences， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China； 2. Zhumadian Tobacco Company of Henan Province， Zhumadian 463000， China； 3. College of Life Sciences， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China）

Abstract： In order to elucidate the characteristics of leaf water retention at different developmental stages of flue cured tobacco， excised leaves of three varieties Yuyan 6， ND202 and K326 with different drought resistance 10， 30， 50 and 70 d after transplanted were used as materials to analyze the change of leaf water retention， antioxidant enzyme activities， hormone and stress resistance gene expression. The results showed that variety， growth stage and their interaction all had significant effects on the water holding capacity， with the contribution rates being 63.09%， 24.65% and 12.25%， respectively. The water holding capacity of leaves of the three varieties was relatively higher at the late stage， with Yuyan6 being the highest and ND202 being the lowest at the same development stage. The activities of antioxidant enzymes （SOD， POD， CAT） were all increased after dehydration， and the increase of Yuyan 6 was the largest. The activities of SOD and POD increased greatly at the late stage. The increase of MDA content and relative conductivity of the three varieties were lower at later stage， and Yuyan6 had the lowest increase. After dehydration， the content of ABA increased， the content of IAA decreased slightly， and the contents of IAA， CTK and GA decreased obviously at the later stage. The expression levels of four stress responsive genes （AREB， CDPK2， LEA5， ERD10C） increased greatly after dehydration， and the largest increase was found in Yuyan 6， followed by K326 and ND202， which is consistent with the trend of water retention between varieties. The results suggested that the genetic factors of the varieties were the key factors affecting water holding capacity of tobacco， and leaf water retention could be used in drought resistance identification at different developmental stages in the field.

Keywords： leaf water retention capacity； growth and development stage； variety factor； stress responsive gene

基金项目：河南省烟草公司驻马店市公司项目“驻马店烟区特色烤烟品种筛选与配套技术研究”（ZMDKJ201502）；河南省烟草公司重点项目

“烤烟抗旱分子标记的开发及其育种应用潜力研究”（HYKJ201401）

作者简介：许志文（1992-），男，在读硕士，研究方向：烟草遗传育种。E-mail：xzw15218026@163.com。*通信作者，E-mail：zxq013415@163.com

收稿日期：2017-10-27 修回日期：2018-01-08

水分是调控烟株生长发育并影响烤烟产质量的关键因素。持续水分胁迫容易导致烤烟光合作用受阻，生长发育受到抑制，内在化学成分失调，产质量大幅下降[1-3]。叶片保水力是叶片在离体条件下保持自身水分的能力，作为重要抗旱性鉴定指标具有操作方法简单、样本容量大的优点，在小麦[4]、玉米[5]、油菜[6]、烟草[7]、红树等[8]抗旱性鉴定中有大量应用。吴兆苏[9]认为测定离体叶片保水力可能是筛选小麦抗旱性最有希望的技术。

大量研究表明叶片保水力的大小与植物遗传性、细胞特性和原生质胶体性质有关，同时与叶片发育状态相关。CLARKE等[10-11]对不同发育阶段不同基因型的硬质小麦离体叶片保水力进行了测定，发现不同发育时期叶片保水力存在差异，得出了需在抽穗期之前完成取样的结论。张小全等[12]研究表明，烤烟叶片保水力的合适测定时间为离体叶片自然失水24 h，且相同发育时期不同叶位之间保水力差异不显著。而不同烤烟品种在不同发育时期叶片保水力变化特征却不清楚。本研究以抗旱性不同的3个烤烟品种豫烟6号、ND202和K326为材料[13]，研究了烤烟品种与发育时期对叶片保水力的影响，测定了不同发育时期3个烤烟品种抗氧化酶活性、激素和抗逆胁迫响应基因表达量的变化特征，以期探明品种与发育时期对叶片保水力影响的机制，为应用叶片保水力作为烟草抗旱性鉴定和抗旱育种选择指标提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

选用抗旱性不同的豫烟6号、ND202和K326为试验品种。试验于2016年在河南农业大学许昌校区进行，选取3个品种整齐一致的烟苗于4月30日移栽至大田，株距55 cm，行距120 cm。每品种种植4行，每行100株。供试土壤为轻壤土，土壤中碱解氮含量为48.8 mg/kg，速效磷含量为51.7 mg/kg，速效钾含量为103.9 mg/kg，pH为7.7。田间管理措施按当地优质烟叶栽培技术規程进行。

于移栽后10 d（还苗期）、30 d（团棵期）、50 d（旺长期）和70 d（圆顶期），分别选取各烟株正常生长，叶片完整、朝向一致中部叶片9片，用于叶片保水力及相关生理指标的测定。

1.2 测定指标与方法

1.2.1 叶片保水力的测定 采用离体叶片自然失水法测定，具体步骤如下：早上8：00—9：00在田间摘取叶片后，迅速装入塑料封口袋密封，置于冰盒内迅速带回人工气候室（温度25±1 ℃，相对湿度40%）。将样叶取出，迅速擦干叶片上沾有的水分，选取3片叶用电子天平称取叶片鲜质量（mf0），而后悬挂于人工气候室内，24 h后再次称其质量，获得每个样品的mf24。然后将称量后的叶片105 ℃杀青30 min，95 ℃烘干至恒质量，称取干质量（md）。分别在0 h和24 h各选取6片叶，用于相关生理指标含量变化测定。叶片保水力采用下面公式计算：

叶片保水力（%）= （mf24-md）×100/（mf0-md）

1.2.2 生理指标测定 抗氧化酶活性测定参考文献[14]的方法。丙二醛（MDA）含量和相对电导率参照李合生[15]的方法测定。可溶性蛋白含量测定参照考马斯亮蓝法测定[16]。脱落酸（ABA）、生长素（IAA）、细胞分裂素（CTK）和赤霉素（GA）含量的测定采用酶联免疫吸附分析法[17]。

1.2.3 胁迫响应基因的相对表达量分析 样品总RNA的提取按照美国Invitrogen公司TRIZOL试剂说明书操作，反转录参照立陶宛Fermentas公司的RevertAid TM First Strand cDNA Synthesis Kit产品说明书进行，合成第一链cDNA。PCR扩增采用BioRad iQ5实时定量PCR仪进行。反应结束后将荧光值（CT）导入Excel 2007，按照公式2-△△CT计算目的基因的相对表达量[18]，并绘制基因表达差异图。AREB、CDPK2、ERD10C和LEA5为4个研究较多的干旱胁迫响应基因[19-22]。内参基因（ACTIN2）和4个胁迫响应基因的引物信息参考文献[23]。

1.3 数据处理

试验数据的统计分析采用DPS 7.05和Excel 2007进行。

2 结 果

2.1 不同发育时期叶片保水力变化

由表1看出，品种、发育时期以及两者互作3个因素均对烤烟叶片保水力有极显著的影响，品种、发育时期以及两者互作对叶片保水力的贡献率分别达到了63.09%、24.65%和12.25%。说明品种因素对叶片保水力起着关键作用，不同发育时期叶片状态以及叶片与生长环境的互作也对烤烟叶片保水力有重要的影响。

由表2看出，3个品种的叶片保水力均表现为叶片发育后期相对较高，豫烟6号和K326移栽后50 d左右叶片保水力达到最大，ND202移栽后70 d左右叶片保水力达到最大。移栽后10、30、50和70 d各品种中部叶片的保水力均表现为豫烟6号最高、ND202最低，豫烟6号在4个时期均显著高于ND202。说明烤烟不同发育时期的叶片保水力是变化的，但在相同发育时期品种间的趋势是一致的。

2.2 不同发育时期叶片离体失水前后生理指标变化

3个品种不同发育时期叶片失水24 h前后的生理指标测定结果显示，不同发育时期叶片失水后抗氧化酶活性均呈现不同程度的上升，其中以豫烟6号增幅最大（图1A、B、C），说明豫烟6号抗逆反应较为高效。3个品种叶片失水前后SOD活性的增幅随发育时期呈不断扩大趋势（图1A），POD活性增幅也表现为移栽后50 d较高（图1B），说明随着叶片发育，各结构功能趋于完善，抗逆反应变得更加高效。不同发育时期叶片经过24 h失水，叶片可溶性蛋白含量均增加，且同时期均为豫烟6号增幅最大（图1E）。烤烟叶片失水后相对电导率以及MDA含量均不同程度增加，同时期以豫烟6号增幅最小，ND202增幅最大（图1D、F），说明豫烟6号叶片细胞伤害程度较轻，ND202最重，这与同时期保水力趋势相一致。MDA含量、可溶性蛋白含量以及相对电导率增幅均在移栽后70 d时表现出最小（图1D、E、F），与此时期气温较高，叶片蒸腾失水较多且频繁，且叶片已发育完全，使叶片对脱水有了较强的适应能力，叶片细胞抗脱水能力也有所增强有关。

2.3 不同发育时期叶片离体失水前后激素含量变化

表3显示，各品种叶片失水后ABA含量均表现升高，豫烟6号增幅较大，说明其抗逆反应较为高效。IAA含量略有降低。ABA水平随发育时期呈先升后降趋势，移栽后50 d时达到最高值。促进植物生长发育的IAA、CTK、GA含量均表现为叶片发育后期明显低于前期，与后期叶片发育逐渐完成，生长需求降低一致。

2.4 不同发育时期烤烟叶片抗逆基因相对表达量变化

4个干旱胁迫响应基因的相对表达量分析结果显示（图2），叶片失水24 h后4个基因的相对表达量均显著升高，各时期增幅均表现出豫烟6号>K326>ND202，与品种间叶片保水力趋势相一致。不同发育时期3品种鲜叶片的各胁迫应答基因表达量均无显著差異，说明在正常水分条件下品种间胁迫响应基因表达状况较为接近，在感受到水分亏缺后不同品种的胁迫应答基因会做出不同程度的反应，从而造就了不同品种叶片保水力不同，抗旱性也不同。说明不同烤烟品种的叶片保水力差异主要是由品种的遗传因素决定的。

3 讨 论

保持水分散失与自身吸水率间的平衡是植物维持自身含水量的重要途径[24]。植物的吸水主要通过根系，但水分散失主要通过叶片。叶片离体以后吸水途径丧失，只能通过保持自身水分来维持细胞平衡，此过程中会发生一系列代谢反应并最终通过叶片保水力反映出来。因此，离体叶片的保水力可以反应植物原生质的耐脱水能力和叶片角质层的保水能力。对3个烤烟品种不同发育时期叶片离体24 h前后抗氧化酶活性、MDA含量、相对电导率、激素和抗逆胁迫响应基因表达量的变化特征研究发现，保水力高的品种豫烟6号胁迫响应相关基因AREB、CDPK2、LEA5和ERD10C的相对表达量增幅均最大，干旱胁迫信号激素ABA含量的上升幅度、清除活性氧应激的抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性的上升幅度在各时期也均最大。说明烤烟品种本身的遗传因素是影响烤烟叶片保水力的关键因素。

本研究发现，发育时期因素对烤烟叶片保水力有极显著的影响，贡献率达到24.65%，不同发育时期的烤烟叶片保水力存在显著差异，与CLARKE等[10-11]在小麦上的研究结果一致。3个品种的叶片保水力均表现为叶片发育后期相对较高。移栽后10d豫烟6号和K326中部叶的叶片保水力均极显著的低于之后时期，ND202则是在移栽后70 d叶片保水力才显著的增加，与田间ND202前期地上部分生长发育较慢，叶片伸长和扩展较其他2个品种滞后的现象一致。烟草叶片的生长分为3个时期，一是细胞分裂生长期，即从幼叶出现到定型叶长的20%～40%为止，叶片增大以细胞分裂增加为主；二是细胞伸长生长期，从定型叶长度的20%～40%到70%～80%，此时期叶面积的增大以细胞伸长为主；三是细胞腔隙扩展期，从定型叶长度的70%～80%到叶片定长为止，叶片增大以细胞间隙填充为主[25]。移栽后30 d到70 d，烤烟中部叶片逐渐由细胞分裂生长期变化到细胞腔隙扩展期，叶片内含物增加，叶片组织结构由疏松变紧凑，且角质层发育逐渐完整，因此叶片保水力随着发育时期的推进逐渐增加。田间烤烟生长发育后期气温较高，叶片频繁遭遇大量蒸腾失水，植株常处于水分胁迫状态，IAA、GA等生长发育相关激素含量会降低以减缓自身生长，提高抗旱力，减轻逆境造成的伤害[26]，这可能也是本试验中烤烟发育后期保水力较高的原因。烤烟叶片的保水力高低与品种本身的遗传因素、叶片的发育时期均相关，品种的遗传因素是影响烤烟叶片保水力的关键因素。因而，在应用叶片保水力作为烟草抗旱性鉴定和抗旱育种选择指标时，在相同的环境条件、相同的发育时期、相同的叶位取样鉴定，叶片保水力的高低可反映出不同材料抗旱性能的强弱。而不同品种叶片自身结构对叶片保水力的影响，以及品种间胁迫响应基因表达高低不同的原因尚不明确，可对叶片超微结构、角质层及抗逆基因的时空表达规律等进一步深入研究。

4 结 论

烤烟品种、发育时期以及两者互作均对烤烟叶片保水力有极显著的影响，品种因素对叶片保水力的贡献率达到了63.09%。叶片保水力随着发育时期

的推进逐渐增加，同一发育时期叶片保水力均为 豫烟6号最高，ND202最低。不同发育时期3个烤 烟品种抗氧化酶活性、激素和抗逆胁迫响应基因表 达量变化特征的研究结果也证实，品种的遗传因素 是影响烤烟叶片保水力的关键因素，在烤烟田间生 长各时期均可测定叶片保水力进行抗旱鉴定。

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