甘肃省玉米大斑病菌生理小种结构组成与交配型测定

郭建国 杨凤珍 杜蕙

摘要 为了明确甘肃玉米大斑病菌生理小种与交配型的结构组成，采用单基因鉴别寄主测定了甘肃4个典型生态区57株玉米大斑病菌的抗、感反应型，对峙培养显微观测法测定了它们与标准菌株雜交是否产生有性态子囊壳。结果表明，甘肃玉米大斑病菌生理小种结构组成十分复杂，57株病菌中共发现0、1、12、23、123、N、1N、2N、3N、123N共10个生理小种，0号以61.40%分布频率成为优势生理小种，1号以17.54%分布频率成为次优势生理小种，23号生理小种出现频率仅为5.26%、123和N号生理小种出现频率仅为3.51%，12、1N、2N、3N、123N生理小种出现频率仅为1.75%，4个典型生态区中河西灌溉绿洲生态区生理小种结构组成最为复杂，15株病菌中共检出0、1、N、12、1N、2N、3N、123N 8个生理小种，中部干旱雨养、陇东半湿润半干旱和南部湿润生态区生理小种结构组成相对简单，42株病菌共检出0、1、23、123和N号5个生理小种。相对而言，甘肃玉米大斑病菌交配型结构组成简单，57株病菌中共检出A型22株、a型24株， Aa型11株，分布频率分别为38.6%、42.1%和19.3%；其中河西灌溉绿洲、中部干旱雨养和陇东半湿润半干旱生态区45株病菌共检出18株A型、18株a型和9株Aa型，A∶a比例完全符合1∶1，南部湿润生态区12株病菌共检出4株A型、6株a型和2株Aa型，A∶a比例小于1∶1。

关键词 玉米大斑病菌； 生理小种； 交配型

中图分类号： S 435.131.4

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018066

Abstract To understand the virulence and sexual structure of the causal agent of northern corn leaf blight in Gansu， the reaction types of 57 isolates ofSetosphaeria turcicacollected from Gansu on two sets of differential hosts were tested， and their mating types were also determined by using standard strains. The results showed that their structural composition of natural populations ofS.turcica was complex. A total of 10 races were found in 57 strains， including 0， 1， 12， 23， 123， N， 1N， 2N， 3N and 123N. Race 0 was dominant with a frequency of 61.40%； race 1 was subdominant with a frequency of 17.54%； race 23 accounted for only 5.26%； races 123 and N accounted for 3.51%， and races 12， 1N， 2N， 3N and 123N accounted for 1.75%. The race composition ofS.turcica in irrigated oasis of Hexi was the most complicated： eight races were found in 15 isolates ofS.turcica， including 0， 1， N， 12， 1N， 2N， 3N， and 123N. The structural composition ofS.turcica races in central rainfed drylands， eastern semi-humid and semi-arid regions and southern humid region was comparatively simple in the four typical ecoregions in Gansu： a total of five races were found in 42 isolates ofS.turcica， including 0， 1， 23， 123 and N. In contrast， the structural composition of mating types was very simple： 22 isolates of A type， 24 isolates of a type and 11 isolates of Aa type were detected in 57 isolates， accounting for 38.60%， 42.10% and 19.30%， respectively. Among them， 18 A type， 18 a type and nine Aa type were detected among 45 isolates in the irrigated oasis of Hexi， central rainfed drylands and eastern semi-humid and semi-arid regions， with an approximately 1∶1 proportion of A to a. Moreover， four A type， six a type and two Aa type were detected in 12 isolates from the southern humid region， with a proportion less than 1∶1 of A to a.

Key words Setosphaeria turcica； physiological race； mating type

玉米大斑病（northern corn leaf blight，NCLB）是由有性态大斑刚毛球腔菌Setosphaeria turcica（Luttrell）Leonardet Suggs、无性态大斑凸脐蠕孢Exserohilum turcicum（Pass.）Leonardet Suggs引起的一种以产生大型条形病斑为主的叶枯性病害，在全球冷凉湿润玉米产区易暴发流行，一般年份减产20%左右，严重年份减产50%以上，并会加重玉米根病和茎腐病等病害流行，严重影响玉米产量和品质。国内外研究表明，玉米大斑病菌存在寄主分化现象[1]，具有明显的小种生理分化现象[2]，已报道的有 0、1、2、3、N、12、13、1N、23、2N、3N、123、12N、13N、23N和123N等16个类型的生理小种，0号和1号小种是当前我国的优势生理小种[3]。

有性杂交是病菌变异与致病性增强的有效途径[4]，病菌群体遗传结构变化是品种抗性丧失的客观原因[5]。甘肃是中国西部内陆干旱省份，东南至西北降雨量递减，气候呈现东南湿润、中部干旱和西北高寒的特征，玉米种植形成了河西制种与河东高产栽培的两翼结构，中部和陇东、陇南中晚熟玉米数量较多，生育期偏长[6]。環境条件多样与物候期延长为该病害发生提供了良好的环境，致使玉米叶部病菌产孢量增加，变异速率加快，侵染循环周期缩短，发生普遍率和严重度日益增加，已严重影响甘肃玉米的生产安全[7]。为此，本研究于2013—2014年采集了甘肃河西灌溉绿洲、中部干旱雨养、陇东半湿润半干旱和陇南湿润生态区的玉米大斑病标样，室内分离纯化后进行了生理小种鉴定与交配型测定工作，旨在明确甘肃玉米大斑病菌生理小种和交配型结构组成，掌握病菌变异方向，制订该病害的防治策略。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：2013-2014年采集甘肃河西灌溉绿洲（酒泉、张掖和武威）、中部干旱雨养（定西）、陇东半湿润半干旱（平凉和庆阳）和南部湿润生态区（天水和陇南）的玉米大斑病样，带回室内自来水冲洗干净晾干后，剪取病健交界处面积为0.5 cm×0.5 cm的叶片4～5块，于75%乙醇中表面消毒2～3 min后，无菌水冲洗3～4次，无菌滤纸吸水后置于PDA平板上在25℃条件下光照培养，待菌落产孢后在显微镜下挑取单孢进行分离纯化，获得酒泉地区菌株5株、张掖地区5株、武威5株、定西5株、平凉8株、庆阳17株、天水6株、陇南6株，共57株菌株于4℃冰箱保存备用。

鉴别寄主：2套含Ht单基因鉴别寄主分别为Oh43Htl、Oh43Ht2、Oh43Ht3、Oh43HtN和Oh43（对照）及黄早四Htl、黄早四Ht2、黄早四Ht3、黄早四HtN和黄早四（对照）。2013-2014年人工套袋扩大繁殖种子后备用。

交配型标准菌株：A（编号：01～15）和a（编号：01～12）由河北农业大学真菌毒素与植物分子病理学实验室曹志艳副教授提供。

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：马铃薯200 g、琼脂粉15 g、葡萄糖20 g，补蒸馏水至1 000 mL，灭菌。

Sach培养基：马铃薯200 g，K2HPO4 0.25 g，CaCO3 4.0 g，Ca（NO）2 1.0 g，MgSO4 0.25 g，FeCl3 0.02 g，琼脂11.0 g，加蒸馏水至1 000 mL，灭菌。

仪器：JA5003精密电子天平，上海良平仪器仪表有限公司；YXQ-LS-50SII立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司；1 000～10 000 μL艾本德（Eppendorf）单道可调量程移液器，南京贝登生物科技有限公司；OLYMPUS CX41RF显微镜，普赫（上海）光电科技有限公司；MLR-351H多功能人工气候箱，日本三洋电器集团。

1.2 方法

1.2.1 生理小种测定方法

将鉴别寄主种子经2%次氯酸钠表面消毒后，于25℃培养箱催芽24 h，萌动后将6粒种子播种于直径 15 cm装满营养土的花盆内，出土后留苗3株。然后将单孢纯化的玉米大斑病菌在PDA平板于26℃条件培养10 d进行扩繁，待病菌产生大量分生孢子后加适量无菌水刮洗菌落，双层纱布过滤除去菌丝碎片，配制成1×105～1×106个/mL的分生孢子悬浮液，滴加1～2滴0.1%吐温20振荡摇匀，隔离喷雾接种100 mL于6～8叶期鉴别寄主上，接种后在温度18～25℃、相对湿度95%塑料棚内保湿48 h后转入温室进行正常管理。每隔3 d观察一次叶片发病状况，记载病斑出现日期，接种后第14 天参照R型褪绿斑和S型萎蔫斑标准系统调查反应型。鉴定标准[8]为，R型：病斑初为黄绿色水浸状条斑，后中间部位变褐成窄条形坏死斑，边缘有明显较宽的黄色晕圈，病斑狭长，出现早，枯死慢，不产生或很少产生孢子，称为褪绿斑；S型：病斑初为灰绿色水浸状斑，后扩大为灰褐色梭形坏死大斑，边缘无明显晕圈，出现晚，枯死快，病斑周围有明显的萎蔫中毒区，条件适宜时产生大量褐色霉层，称为萎蔫斑。生理小种命名采用Leonard的命名方法[9]，并参照刘国胜等的毒力标识，小种的毒力公式为有效抗病基因/无效抗病基因[10]，小种描述标准见表1。

1.2.2 交配型测定方法

首先将大麦秸秆剪成8.8 cm长度的小段，经高压湿热灭菌后半埋于直径 90 mm Sach培养基平板中，然后将标准菌株A或a与待测菌株对峙接种[11]于大麦秸秆两侧1.5～2 cm处进行有性杂交诱导。每个待测菌株设6次重复，于25℃培养箱培养4周后显微镜下观察大麦秸秆上是否真正形成了子囊和子囊孢子，产生了子囊壳。玉米大斑病菌为异宗配合真菌，能与A型菌株交配产生子囊壳的为a型菌株，能与a型菌株交配产生子囊壳的为A型菌株，既能与A型又能与a型菌株交配产生子囊壳的为Aa菌株，既不能与A型也不能与a型交配产生子囊壳的为中性菌株[12]。按此原则确定供试菌株交配型。

2 结果与分析

2.1 甘肃玉米大斑病菌生理小种和交配型结构组成

结果表明（表2、图1和图2），甘肃玉米大斑病菌自然群体生理小种结构组成总体较为复杂，57株菌株中除未检测出2、3、13、12N、13N、23N生理小种外，共发现0、1、12、23、123、N、1N、2N、3N、123N等10个类型生理小种，0号为优势生理小种，出现频率高达61.40%，1号为次优势生理小种，出现频率为17.54%，23号生理小种出现频率为5.26%、123和N号生理小种均为3.51%，12、1N、2N、3N、123N生理小种出现频率均为1.75%。相对而言，甘肃玉米大斑病菌自然群体交配型结构组成十分简单，57株病菌中未检测出中性菌株，共检出A型菌株22株、a型24株， Aa型11株，出现频率分别为38.60%、42.10%和19.30%，A与a菌株比例接近1∶1。

2.2 甘肃不同生态区玉米大斑病菌生理小种结构组成

结果表明（表2、表3），河西灌溉绿洲生态区生理小种结构组成相对复杂，15株病菌中共检出0、1、N、12、1N、2N、3N、123N等8个生理小种，0号为优势生理小种，出现频率达46.67%，1号为次优势生理小种，出现频率为13.33%，12、N、1N、2N、3N、123N号为非优势生理小种，出现频率均为6.67%；中部干旱雨养、陇东半湿润半干旱和南部湿润生态区生理小种结构组成相对简单，其中中部干旱雨养生态区5株病菌共检出0、1和N号3个生理小种，0号为优势生理小种，出现频率为60.00%，1号和N号为非优势生理小种，出现频率均为20.00%，陇东半湿润半干旱生态区25株病菌共检出0、1、23和123号4个生理小种，0号为优势生理小种，出现频率为60.00%，1号为次优势生理小种，出现频率为20.00%，23和123号为非优势生理小种，出现频率分别为12.00%和8.00%，南部湿润地区12株病菌共检出0号和1号2个生理小种，0号为优势生理小种，出现频率为83.33%， 1号次优势生理小种，出现频率为16.67%。

2.3 甘肃不同生态区玉米大斑病菌交配型结构组成

结果表明（表2、表4），河西灌溉绿洲生态区15株病菌中共检出6株A型、6株a型、3株Aa型，中部干旱雨养生态区5株病菌中共检出2株A型、2株a型、1株Aa型，陇东半湿润半干旱生态区25株病菌共检出10株A型、10株a型和5株Aa型，出现频率均分别为40.00%、40.00%、20.00%，其中A型和a型菌株出现比例符合1∶1；南部湿润生态区12株病菌共检出4株A型、6株a型和2株Aa型，出现频率分别为33.33%、50.00%和16.67%，其中A型和a型菌株出现比例小于1∶1。

3 讨论

玉米大斑病是影响玉米中后期产量形成的一种严重叶枯病害，病原随寄主协同进化中适合度增强是克服品种抗性的重要表现形式。通过监测病原群体遗传结构的改变，根据病菌的致病性遗传特征选育抗病品种是该病害控制的一种经济有效方法，但由于病原菌菌丝体普遍呈现多核现象，不同细胞核均能发育成单个菌体[3-14]，这种自然现象不仅有利于保持病菌群体的遗传多样性，而且使病菌种群结构组成易受生境影响出现新的致病小种[15]。甘肃生态环境复杂、玉米种植结构多样，境内4大典型生态气候区和两翼种植结构易使大斑病菌群体结构组成多元化。本研究发现甘肃玉米大斑病菌群体结构组成较为复杂，57株菌株中共出现0、1、12、23、123、N、1N、2N、3N、123N 10个生理小种，0号以高频率分布成为优势生理小种，1號为次优势生理小种，4个典型生态区中河西制种玉米大斑病菌结构组成十分复杂，15株病菌中共出现0、1、N、12、1N、2N、3N、123N 8个生理小种，中部干旱雨养、陇东半湿润半干旱和南部湿润生态区普通玉米病菌结构组成相对简单，42株病菌共出现0、1、23、123和N号5个生理小种，这一研究结果与前人研究结果基本一致[16-17]，说明品种选择是病原群体结构多元化的内在影响因子[18-19]，气候环境是优势生理小种流行的外在因素[20]，多品种组合持续选择易使病原群体结构复杂化[21]，单一或简单组合易使优势小种大流行[22]，123N复合型致病性生理小种的出现今后将严重威胁着Ht基因骨干自交系的利用[23]。

有性生殖是异宗配合病菌致病性变异的一种重要途径[24]，该过程易使具有亲和交配型菌株的毒性基因叠加或重组产生新的致病类群[25]，有利于拓宽病菌致病寄主范围，增强病害流行风险性[26]。本研究发现，甘肃57株玉米大斑病菌中除未发现中性菌株外共检出A型22株、a型24株， Aa型11株，4个典型生态区中河西灌溉绿洲、中部干旱雨养和陇东半湿润半干旱生态区45株病菌共检出18株A型、18株a型和9株Aa型，A∶a比例符合1∶1，南部湿润生态区12株病菌共检出4株A型、6株a型和2株Aa型，A∶a比例小于1∶1，该研究结果与我国东北、华北和西南玉米大斑病菌交配型监测结果基本一致[27]，说明甘肃玉米大斑病菌的交配变异在地理尺度上具有一定相似性，河西灌溉绿洲、中部干旱雨养和陇东半湿润半干旱3个典型生态区病菌致病性的变异是由A型与a型按1∶1比例以及Aa型与A型或a型按1∶2比例的有序交配形成的，而南部湿润地区病菌致病性的变异是由A型与a型按2∶3比例以及Aa型与A型按1∶2比例或Aa型与a型按1∶3比例有序交配形成，不同生态区Aa型菌株所占比例很可能是病原群体结构差异的根源。因此，针对不同生态类型多样和两翼种植结构，如何稳定或降低玉米品种对大斑病菌选择压力、延缓病菌生理分化速率、延长品种寿命或组合开发广谱抗性品种是今后共同关注的课题。

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（责任编辑：田 喆）