聚多曲霉Snef210对南方根结线虫毒性的研究

王帅 郭龙玉 朱晓峰

摘要 蔬菜根结线虫病在我国乃至世界危害日益严重，安全防控该病害成为目前急需解决的农业生产问题。本研究筛选到一株可毒杀南方根结线虫Meloidogyne incognita的生防真菌Snef210，经形态学和分子生物学鉴定为聚多曲霉Aspergillus sydowii （Bain.et Sart.） Thomet Church。该菌株发酵液对南方根结线虫2齡幼虫（J2）具有很强的毒杀作用，原液处理24 h后校正死亡率达90.1%，处理3 d后对卵孵化的抑制率达92.8%。盆栽试验中，与对照相比，菌株发酵液10倍稀释液土壤处理对番茄根部的根结减退率为66.7%。聚多曲霉代谢产物丰富，多用于抗菌和抗肿瘤的研究，本文首次发现其对南方根结线虫有效，是一类潜在的控制植物线虫病害的新型生防因子。

关键词 聚多曲霉； 南方根结线虫； 番茄； 毒性

中图分类号： S 476

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018045

Abstract Disease of root-knot nematode （RKN） is becoming more serious in China and other countries. It is an urgent problem to control this nematode in agricultural production. Snef210 was screened with high efficacy againstMeloidogyne incognitaand identified asAspergillus sydowii with morphological and molecular analysis. Second stage juveniles （J2） and egg capsules were immersed in Snef210 with in vitro methods. The results showed the corrected mortality of J2was 90.1% at 24 h. Moreover， Snef210 exhibited high ovicidal effect with the efficacy of 92.8% at 3 d. Root-knot index treated with diluted ten-fold Snef210 fermentation broth was decreased by 66.7% in pot experiment.A. sydowii is rich in metabolic products， mostly used in antibacterial and anti-tumor studies. Snef210 had strongly toxicity toM. incognita and could be regarded as a novel potential biocontrol agent against RKNs.

Key words Aspergillus sydowii； Meloidogyne incognita； tomato； toxicity

近年来，随着日光温室等设施园艺种植模式在北方的大面积推广应用，南方根结线虫Meloidogyne incognita 得以越冬存活，致使根结线虫病发展成为东北地区危害设施蔬菜生产的重要土传病害之一，制约了设施蔬菜产业的发展。根结线虫是在植物根系内定殖的专性内寄生病原物，因其分布范围广和寄主种类多的特点，给许多国家的农林产业造成巨大损失，已成为世界上威胁农业生产的主要病原物之一[1]。

随着科技的进步和人们环保意识的加强，从生态角度寻求控制根结线虫的生物防治新方法成为研究热点[2-3]。生防真菌因种类繁多且代谢产物丰富多样，在植物线虫病害的生物防治研究中最早被发现和应用[4]。我国研究人员陆续报道不同种类真菌在根结线虫病中的研究，如哈茨木霉对黄瓜根结线虫的防治效果显著[5]，青霉菌的代谢产物对多种植物线虫有强烈的毒杀作用且对环境影响小[6]，李颂等施用黑曲霉次生代谢产物的处理降低了番茄的根结指数和根结线虫种群数量，促进了番茄植株的生长[7]。

聚多曲霉Aspergillus sydowii亦称为喜多氏曲霉，是自然界重要的生物资源。属于丝孢菌目丛梗孢科曲霉属的一个种，可生长在土壤、粪便、酒曲等多种材料的基物上[8]。聚多曲霉代谢产物非常丰富，目前研究主要集中于抗菌、抗病毒[9-10]以及抗癌活性[11]，但是尚未见到应用其防治根结线虫病的研究。本文在研究根结线虫生防菌的活性筛选过程中，分离获得一株高效的生防真菌Snef210，经鉴定为聚多曲霉A.sydowii，并进行了室内毒力测定和盆栽防效试验，以验证其生防潜力，为植物线虫病害的生物防治提供新的生防资源。

1 材料与方法

1.1 真菌Snef210菌株的鉴定

1.1.1 供试菌株与菌株发酵液

供试真菌Snef210菌株，由本实验室从辽宁省沈阳市康平试验基地大豆田土壤中分离获得。菌株培养采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar， PDA），菌株纯化和鉴定采用查氏琼脂培养基（Czapek-Dox agar， CDA），菌株保存采用10%的甘油放置于-80℃冰箱中。选取平板上生长良好的菌落，取直径1 cm的菌饼接种于含有150 mL马铃薯蔗糖培养液的三角瓶中，120 r/min，27℃条件下摇床中振荡培养5 d，获得真菌发酵液原液。发酵液原液5 000 r/min离心15 min，获得发酵液上清液，作为菌株发酵液保存到4℃冷库中备用。

1.1.2 菌株Snef210的鉴定

主要依据形态学鉴定以及ITS、β-tubulin序列分析方法对Snef210菌株进行鉴定。将菌株Snef210进行单孢分离，接种到PDA、CDA平板上培养，采用光学显微镜及扫描电镜对菌落、菌丝和孢子等结构进行观察，参照《中国真菌志》[8]进行鉴定。

利用TIANGEN公司的DNA提取试剂盒提取菌株Snef210总DNA，然后进行PCR扩增，扩增引物为ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG 和ITS4： TCCTCCGCTTATTGATATGC[12]，以及β-tubulin基因间隔区通用引物Bt2a：GGTAACCAAATCGGTGCTGCTT 和 Bt2b：ACCCTCAGTGTAGTG-ACCCTTGGC[13]。ITS扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，56℃复性1 min，72℃延伸2 min，30次循环；72℃延伸5 min，4℃下保存。β-tubulin扩增程序为：94℃预变性3 min；94℃变性50 s，53℃复性1 min，72℃延伸2 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物采用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。经过PCR扩增后的产物由上海生物工程有限公司纯化测序，并将测序获得的序列结果提交NCBI（http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov）， 进行BLAST 序列比对，然后通过MEGA 6.0 软件采用Neighbor-joining法绘制系统发育树，在分子水平鉴定菌株的种类。

1.2 供试南方根结线虫卵与2龄幼虫J2

采集铁岭市李千户镇营盘村温室大棚中南方根结线虫侵染的番茄根系，用水轻轻冲掉根上泥土，取下卵囊放在自制的孵化池中，0.5%的NaClO消毒3 min，之后用无菌水冲洗5次，将处理后的卵囊悬液置于25℃恒温箱中培养，每隔24 h收集一次新孵化的南方根结线虫J2置于4℃冰箱中保存备用。

1.3 真菌Snef210发酵液对南方根结线虫的毒力测定

1.3.1 发酵液对南方根结线虫J2活性的影响

取直径6 cm一次性培养皿，加6 mL离心处理后的发酵液上清液，并挑取100条J2置于其中，分别在处理6、12、24、36、48、60 h后，统计死亡根结线虫J2数量，试验前期线虫死亡通过线虫弯曲程度或用挑针刺激法判断[14-15]。最后一次检验时，线虫死亡通过亚甲基蓝水溶液判断，每个皿中加入2滴0.05%亚甲基蓝水溶液10 min时镜检，虫体蓝色为死虫，不着色为活虫[16]。1.8%阿维菌素乳油稀释1 000倍为药剂处理对照，以無菌水处理为空白对照，每个处理重复3次，根据下列公式计算死亡率和校正死亡率：

死亡率= 死亡线虫总数/处理线虫总数×100%；

校正死亡率=（处理线虫死亡率-对照线虫死亡率）/（1-对照线虫死亡率）×100%。

1.3.2 发酵液对南方根结线虫卵孵化的抑制作用

分别取10个卵囊经表面消毒放入自制的孵化池中，孵化池放入直径为6 cm的一次性培养皿中，皿中分别装有10 mL发酵液和1.8%阿维菌素乳油1 000倍稀释液为处理1和处理2，设置10 mL无菌水为对照处理。每个处理设置3次重复，25℃条件下培养箱中孵化，3、5、7 d后在解剖镜下统计孵化出的线虫数量，并依照公式计算出卵孵化的相对抑制率：

相对抑制率=（对照孵化线虫数-处理孵化线虫数）/对照孵化线虫数×100%。

1.4 盆栽试验验证真菌Snef210发酵液对番茄根结线虫的防效

Snef210发酵液稀释10倍后用于盆栽试验。将番茄‘L402的种子用1.0%的NaClO消毒5 min，用无菌水冲洗5次，播种于72孔蛭石穴盘中，温室中培养（白天26℃，晚上16℃）。当番茄苗长到2叶1心期时将苗移到塑料盆钵中（直径25 cm，高30 cm），每钵使用高温灭菌处理的混合培养基质1 000 g（基质∶沙∶土=1∶1∶1）。混合基质中加200 mL稀释10倍的发酵液充分混匀作为处理1，加100 mL稀释10倍的发酵液和100 mL 1.8%阿维菌素乳油稀释1 000倍液为处理2，加200 mL无菌水为空白对照，加200 mL 1.8%阿维菌素乳油稀释1 000倍液为药剂对照，每个处理10盆，每盆一株番茄苗。番茄移栽5 d后接种1 500条南方根结线虫J2，接种45 d后调查根结指数。采用肖炎农等[17]的分级标准统计病情级数，并分别称量不同处理下每株番茄根冠质量，按照下列公式计算根结指数和根结减退率：

根结指数=Σ（各级病株数×相应级别数）/（调查总株数×最高级别数）×100；

根结减退率=（对照根结指数-处理根结指数）/对照根结指数×100%。

1.5 数据分析

试验所获数据由SPSS Statistics18软件进行数据处理，采用独立样本t检验与Duncan氏新复极差法进行多重比较来分析数据（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 菌株Snef210的鉴定

菌株Snef210在查氏琼脂培养基上25℃条件下7 d时直径达到24.0 mm，菌丝绒状至絮状，致密；菌落颜色灰蓝色（图1a）；14 d时菌落直径达到51.4 mm，菌落逐渐变为暗蓝色，有淡褐色区域。7 d时已具大量渗出液，褐色或黄褐色（图1a）；基本无气味或具轻微霉味。菌落反面暗褐色，近于栗黑色，色素扩散于基质中（图1b）。分生孢子头球形至辐射形，直径平均约为75.4 μm，小分生孢子头似青霉状，呈疏松柱形或散乱（1c）；分生孢子梗直接生于基质，有的生于气生菌丝，孢梗茎长大多在140.7～210.5 μm，直径4.7～8.1 μm，壁较厚，光滑。顶囊较小，近球形或稍呈椭圆形，直径8.3～15.2 μm，几乎全部表面可育（图1c，d）；产孢结构双层：梗基（4.3～10.4）μm×（2.0～4.0）μm，有的小分生孢子头仅分生孢梗茎顶端稍膨大后生出产孢细胞（图1c，d）；分生孢子为球形或近球形，直径2.5～5.2 μm，壁明显粗糙，具小刺（图1d）。

将测序获得的序列结果提交NCBI，获得ITS和β-tubulin序列号分别为KY908307和MG831183。通过ITS和β-tubulin序列分析，与GenBank数据库中相关真菌的序列进行比对，结果表明该菌株与已知真菌聚多曲霉KJ463376.1和LN898876.1在ITS序列同源性上达到99%，在β-tubulin序列同源性上为100%。综合考虑菌株Snef210的形态特征与基因测序结果，表明该菌株属于聚多曲霉Aspergillus sydowii （Bain.et Sart.） Thomet Church。

2.2 真菌Snef210菌株发酵液对南方根结线虫J2的毒性

为了验证真菌Snef210发酵液对南方根结线虫J2的毒性，本研究利用1.8%阿维菌素乳油1 000倍稀释液为药剂对照，结果发现除处理36 h外，其余时间两者处理间J2校正死亡率无显著性差异（图4）。Snef210发酵液处理南方根结线虫J2后6 h时其校正死亡率达81.1%，而1.8%阿维菌素稀释液处理线虫6 h时其校正死亡率稍低，校正死亡率为78.1%；随着时间延长，两种处理的线虫死亡数都持续增加，24 h时两种处理的校正死亡率都超过90%，且24 h以后 1.8%阿维菌素稀释液处理线虫校正死亡率稍高于发酵液处理南方根结线虫校正死亡率，但两者无显著差异（图4）。综上可知真菌Snef210发酵液对南方根结线虫J2的毒性与稀释1 000倍的1.8%阿维菌素基本一致（36 h除外）。

2.3 真菌Snef210發酵液对南方根结线虫卵孵化的抑制作用

真菌Snef210发酵液处理南方根结线虫卵囊后，3 d时Snef210发酵液和1.8%阿维菌素乳油稀释液对卵的孵化都起到很好的抑制效果，Snef210发酵液对卵囊孵化的相对抑制率达到92.8%，且0.05水平差异不显著；处理5 d和7 d时，Snef210发酵液虽然也能够显著抑制卵孵化，但相对抑制率显著低于阿维菌素，分别为44.1%与50.6%，说明Snef210发酵液前期对卵囊孵化抑制效果较好（图5）。

2.4 温室盆栽试验效果

在接种线虫45 d后调查盆栽番茄根结指数，发现菌株Snef210发酵液处理番茄后根结指数为17.5，明显低于对照根结指数52.5，根结减退率达到66.7%（表1）。Snef210发酵液与1.8%阿维菌素乳油混用的防治效果好于单独使用阿维菌素处理，但是差异不显著。Snef210发酵液与1.8%阿维菌素混用处理番茄后植株生物量有显著提高，根结减退率也最高，防效最好（表1），处理后的番茄须根比空白对照发达，而对照仅有少量须根。可以看出Snef210发酵液不仅可以控制线虫的侵染，促进番茄的生长，还可以与阿维菌素混合使用增强效果。

3 讨论

Snef210菌株经鉴定为聚多曲霉，其发酵液对南方根结线虫J2有较强的毒性作用，也能显著抑制南方根结线虫卵孵化，与1.8%阿维菌素乳油作用效果相当。盆栽试验显示该菌发酵液能显著减少根结数量，并可以和阿维菌素混配增强防效。研究结果显示该菌发酵液中存在对南方根结线虫有较强毒杀作用的代谢物质，但具体是哪些物质起作用，是单一物质还是多种物质共同作用，有待进一步的研究。

曲霉是自然界重要的微生物资源，在线虫的生物防治中很早就被发现和利用，其中曲霉属、木霉属、青霉属和拟青霉属在线虫的生物防治中研究较多[18-20]，本实验室也曾筛选到一些曲霉菌属和青霉菌属的生防菌[7，15]。青霉菌在根结线虫的防治中还处于简单的筛选和应用，在抗根结线虫的机理方面没有木霉菌属和拟青霉菌属研究深入。相关研究认为曲霉中的柠檬酸、草酸、曲酸等酸性物质是抑制根结线虫的重要原因[21-23]。与报道的曲霉产生酸性物质不同，木霉菌属和拟青霉菌属生防菌株可以通过产生细胞壁降解酶如几丁质酶等寄生于线虫的卵块和2龄幼虫来拮抗南方根结线虫[24-25]，也可以产生一些丝氨酸蛋白酶等毒性物质杀死线虫J2，并且抑制卵孵化[26-27]。本研究鉴定到聚多曲霉Snef210菌株对番茄南方根结线虫有很好的防治效果，但其是否同其他曲霉一样是代谢物中的酸类物质在起作用，还有待进一步的试验验证。

人们研究发现聚多曲霉能够产生多种抗真菌物质如棘球白素[28]、抗病毒的活性物质[9]，同时也能够产生一些对人类细胞瘤有较高毒性的物质[29]，其中一种二酮哌嗪类新化合物对黑素瘤细胞具有较强的毒性[30]。Trisuwan研究得到3种新倍半萜烯类与2种新氧杂蒽酮类物质，并评估了这些物质的抗氧化能力[31]。因此，该菌产生的这些毒性产物和抗氧化物质在引起根结线虫J2的死亡及抑制卵孵化起到多少作用也需要验证。此外，人们陆续发现其在降解农药中的作用，如可以降解甲基对硫磷[32]、敌草隆[33]、S-氰戊菊酯[34]和敌百虫[35]等农药。除了能降解多种农药，该菌能降解甲醛等有毒物质[35]。可见聚多曲霉具有多样化功能，是重要的环境用真菌，其具有的特性必将为聚多曲霉的应用添加优势。

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（責任编辑：田 喆）