液相色谱-原子荧光光谱法测定鱼肉中甲基汞不确定度分析

王艳春 籍术良 杨文英

水产动物及其制品中甲基汞是重要的监测指标，一个完整的测量结果，除了应给出被测量的最佳估计值之外，还应同时给出测量结果的不确定度。本研究依据国家质量监督检验检疫总局(JJF1059.1-2012)“测量不确定度评定与表示”[1]标准，对液相色谱-原子荧光光谱法测定鱼肉中甲基汞进行不确定度分析，在实际工作中有较高的实用价值[2-3]。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

SA-10原子荧光形态分析仪(北京吉天仪器公司)；C18柱(天津博纳艾洁尔)；高速冷冻离心机(德国Sigma公司)；振荡器(德国IKA)。

汞标准溶液：甲基汞溶液(63.6±2.4)μg/g；标准物质：鱼肉(GBW10029)来源于国家标准物质中心。甲醇、乙酸铵(色谱纯)、氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)、硼氢化钾(KBH)、盐酸(HCL)、氨水、L-半胱氨酸(优级纯)以及过硫酸钾(分析纯)来源于北京国药集团化学试剂有限公司。

1.2 测量方法

依据国家标准[4](GB5009.17-2014)“食品中总汞及有机汞测定第三法”，称取样品1.00 g，置于15 ml离心管中，加入5 mol 10 ml的HCl提取试剂，放置过夜。于室温下超声水浴中提取60 min，中间振摇数次。于4 ℃下以离心8 000 r/min的转速离心15 min。取2 ml上清液，缓慢加入1.5 ml的6 mol/L的NaOH，使样液pH值为2～8，加入0.2 ml的10 g/L半胱氨酸溶液定容至5 ml，于4 ℃下以离心8 000 r/min的转速离心15 min，取上清液过0.45 μm有机系滤膜，同时做空白对照。样品滤液与标准曲线在相同的仪器条件下进行分析。

1.3 测量数学模式建立

样品经提取处理后，用液相色谱-原子荧光光谱法进行检测，在一定浓度范围内，其吸光度与甲基汞含量成正比，与甲基汞标准溶液吸光度比较定量。测量不确定度数据模型计算为公式1：

式中X为样品中甲基汞含量(μg/kg)；C为测定样液中汞浓度值(μg/L)；a为截距；b为斜率；V为定容体积(ml)；G为样品质量(g)。

1.4 测量不确定度的来源分析

液相色谱-原子荧光光谱法测定鱼肉中甲基汞不确定度的来源主要有：①样品的称重、提取和定容过程；②标准溶液的纯度和稀释过程；③液相色谱-原子荧光标准方法；④结果的重复测定[5-6]。

2 结果

2.1 不确定度分量的评定

2.1.1 称量过程引入的不确定度u(m)

所用样品可认为样品是均匀的，代表性充分，由此所致的不确定度可忽略不计。根据检定证书可知所用天平的灵敏度为0.001 g，最大允许误差为±0.5e(e=10 mg)，最大允差包括了天平校准、称量变动性引起的最大允许误差(天平显示的数值是自动显示)，即最大允许误差(a)=0.005 g。按均匀分布k=3，其计算为公式2：

由于天平称量了两次(空杯和空杯+样品)，故天平引起的标准不确定度计算为公式3：

式中u空(m)为空杯的不确定度；u样(m)为空杯和样品的不确定度。

由天平引起的相对不确定度计算为公式4：

式中urel(m)为天平引起的相对不确定度。

2.1.2 样品提取过程回收率引入的不确定度u(Rec)

由于样品提取不完全或提取过程中导致甲基汞的损失等，将使鱼肉中甲基汞质量分数不能100%进入到测定液中，本法甲基汞的提取回收率为90%～110%，样品回收率的不确定度计算为公式5：

式中b+为正回收率差值；b-为负回收率差值；b为回收率差值。

2.1.3 样品定容体积影响引入的不确定度U(V)

在样品提取过程中使用了10 ml和2 ml移液管及5 ml单标容量瓶，分别计算不确定度分量。

(1)10 ml移液管不确定度u1(V10)。10 ml单标线移液管证书给出示值允差±0.02 ml，按均匀分布属B类，取k=3，则计算为公式6：

10 ml单标线移液管充满液体至刻度的估读重复性±0.01 ml，按均匀分布属B类，取k=3，则计算为公式7：

由单标线移液管校准温度与使用温度差别引起的不确定度u1.3(V10)：20 ℃时水的体积膨胀系数为2.1×10-4/℃，玻璃的膨胀系数为1.5×10-5/℃。在实验中，实验水温Tt=25 ℃，在95%置信概率下的正态分布取k=2，则计算为公式8、公式9：

(2)2 ml移液管不确定度u2(V2)。2 ml单标线移液管示值允差±0.008 ml，按均匀分布属B类，取k=3，估读重复性±0.005 ml。计算方法与上相似，得u2(V2)=0.27%。

(3)5 ml单标线容量瓶不确定度u3(V5)。5 ml单标线容量瓶示值允差±0.02 ml，按均匀分布属B类，取k=3，估读重复性±0.01 ml。计算方法与上相似，得u3(V5)=0.18%，则定容体积的影响计算为公式10：

样品制备过程引入的不确定度计算为公式11：

2.1.4 标准系列配置引起的不确定度u(CS)

准确称取(63.6±2.4)μg/g甲基汞标准溶液0.315 g于200 ml容量瓶中配制成甲基汞浓度为100.0 μg/L标准使用液，再用1000 μl移液枪分别吸取甲基汞浓度为100.0 μg/L标准使用液0.00 μl、25 μl、50 μl、100 μl、200 μl以及250 μl于10 ml容量瓶中，用流动相配成0.00 μg/L、2.5 μg/L、5.0 μg/L，10.0 μg/L、20.0 μg/L以及50.0 μg/L标准系列。

(1)标准储备液的不确定度u(C0)。本测量所用甲基汞标准为国家标准物质研究中心提供，证书给定(63.6±2.4)μg/g。按均匀分布处理k=3，则计算为公式12：

(2)称量标准储备液引起的不确定度u(G0)。计算过程同2.1.1(称量过程引入的不确定度)计算得u(m)=0.00408 g，由天平引起的相对不确定度计算为公式13：

(3)移液枪、容量瓶示值允差引起的不确定度u(V0)。①由移液枪引起的不确定度u1(V0)，1 000 μl移液枪示值允差±0.2%，移液枪重复性±1 μl，按均匀分布属B类，取k=3；20 ℃时硬橡胶的膨胀系数为1.23×10-5/℃。在实验中，实验水温Tt=25 ℃，在95%置信概率下的正态分布取k=2，在标准液配置过程移液枪使用了5次，计算方法同2.1.3(定容体积的影响引入的不确定度u(V))，u1(V0)=0.32%；②200.0 ml单标线容量瓶引起的不确定度u2(V0)，200.0 ml单标线容量瓶，示值允差±0.10 ml，重复性±0.10 ml，按均匀分布属B类，取k=3，玻璃的膨胀系数为1.5×10-5/℃计算方法同上，u2(V0)=0.081%；③10.0 ml单标线容量瓶引起的不确定度u3(V0)，10.0 ml单标线容量瓶示值允差±0.02 ml，估读重复性±0.01 ml，按均匀分布属B类，取k=3，玻璃的膨胀系数为1.5×10-5/℃，计算方法同上，u3(V0)=0.14%，

2.1.5 最小二乘法拟合标准曲线校准产生的不确定度

直线拟合为最常用、最简单的一种，其给出两个变量x、y间的线性关系。通过测量出一组数据(xi，yi)(i=1，2，…n)，得到的一条直线y=bx+a，所有这些点(xi，yi)与这条直线垂直距离之差的平方和最小，即所谓的最小二乘法。

(1)拟合过程。采用6个浓度水平的甲基汞标准溶液，分别测定2次，得到相应的峰面积(y)，用最小二乘法进行拟合，得到直线方程和相关系数y=19152.2C0+2216.2，r=0.9995(C0为质量浓度，y1为第一次测量的峰面积，y2为第二次测量的峰面积，y为计算值)，见表1。

表1 最小二乘法拟合甲基汞标准溶液质量浓度、峰面积值结果

(2)曲线拟合带来的标准不确定度u(C)其计算为公式14：

式中SR为回归曲线的剩余标准差(残差的标准差)；b为斜率(b=19152.2)；p为待测样品的重复测定次数(p=6)；n为回归曲线的点数(n=12)；为待测样品浓度的平均值(32.72μg/L)；0为标准溶液的平均浓度值；C0j为各标准液浓度值。

剩余标准差SR，也称均方差，在线性回归分析中，真实值和估计值之间的差称为残差，所有预测值的残差平方和(或者剩余平方和)，剩余标准差就是剩余平方和的开平方。用来表示估计值的精度，其计算为公式15：

式中A0J为各标准液的峰面积值；a+bC0为根据回归曲线算出来的理论值。

对样品测定液进行6次测量，由直线方程求得平均质量浓度：

由标准曲线拟合带来的标准不确定度。

(3)标准曲线校准带来的相对不确定度计算为公式16：

2.1.6 结果重复性带来的不确定度

在重复性条件下，对鱼肉样品进行了6次独立实验，测得甲基汞的含量分别为821.11、824.64、811.03、824.62、813.60及812.64，则甲基汞含量的算术平均值计算为公式17：

单次测量的不确定度计算为公式18：

算数平均值的不确定度计算为公式19：

测量结果的相对不确定度计算为公式20：

2.2 合成标准不确定度u(i )

无论是通过A类还是B类评定方法得到各标准不确定度分量后，将各标准不确定分量合成以得到合成标准不确定度，各不确定度分量见表2。

表2 各不确定度分量

表2显示，对测量不确定度影响最大的分量是样品制备过程，其次是配置标准系列所产生的不确定度。

合成标准不确定度计算为公式21：

合成相对标准不确定度结果：

2.3 扩展不确定度

扩展不确定度是确定测量结果区间的量，合理赋予被测量之值分布的大部分可望含于此区间，其计算为公式22：

计算结果：U=52.51μg/L×2=105.02μg/L。

2.4 报告结果

样品报告结果为甲基汞含量的算术平均值加减扩展不确定度，其计算为公式23：

计算结果：ω=(817.94±105.02)μg/L。

3 结论

本研究报告的测量不确定度是在最佳仪器条件下得到的结果，即各被测组分有效分离、共存物质不干扰及实验室温度恒定在实际测定时严格按照测定的要求进行[6-8]。通过不确定度分析发现，用液相色谱-原子荧光光谱法测定鱼肉中甲基汞，不确定度的主要来源是样品制备、标准溶液、标准校准方法以及结果的重复测定[9-10]。其中对测量不确定度影响最大的分量是

样品制备过程，其次是配置标准系列所产生的不确定度。样品制备过程引起的不确定度主要来自样品的提取过程，配置标准系列所产生的不确定度主要来自标准液的配置过程。应用本方法对液相色谱-原子荧光光谱法测定鱼肉中甲基汞含量的进行不确定度分析，使测定结果更加可靠。

参考文献

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