氯霉素与4-乙烯基吡啶分子印迹体系的理论优化与制备

高 芊，刘俊渤，唐珊珊，孙 琳，王光宇，靳瑞发

(1.吉林农业大学资源与环境学院，吉林，长春，130118; 2.赤峰学院化学化工学院，内蒙古，赤峰，024000)

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是一种抑菌效果良好的广谱抗生素类药物，由于会引起人类的再生不良性贫血等疾病，我国农业部于2002年禁止使用该药[1]，规定在所有食品动物的可食组织中不可检出CAP。但由于CAP抗菌性好且价格低廉，养殖业上仍存在违法使用CAP。为有效监控CAP的违禁使用，合成一种能够准确地富集和分离残留于动物源性食品中CAP的新型萃取功能材料是非常必要的。

分子印迹技术也称分子模板技术，是制备空间结构和结合位点与印迹分子相匹配的分子印迹聚合物(Molecularly imprinted polymers，MIPs)的一门分离技术。目前该技术广泛应用于化学传感器、模拟酶催化及药物控释等[2-4]领域。为提高MIPs在复杂基质动物源性食品中对待测物的特异吸附性，近年来分子模拟已广泛应用于MIPs的设计[5-8]，为MIPs的制备提供了理论指导。

目前，国内外有关CAP分子印迹聚合物(CAP-MIPs)的研究主要以甲基丙烯酸(MAA)及丙烯酰胺(AM)为功能单体[9-10]，而以4-乙烯基吡啶(4-Vpy)为功能单体制备CAP-MIPs的相关研究极少，且未见在分子水平上构建空间模型用以研究CAP与4-Vpy的相互作用及CAP印迹体系中交联剂优化的研究报道。因此，本研究以CAP为印迹分子，4-Vpy为功能单体，分别以乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、季戊四醇三丙烯酸酯(PETA)和三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)为交联剂，采用量子化学密度泛函理论(DFT)的ωB97XD方法，从理论上探讨CAP与4-Vpy复合物的构型、印迹作用机理等，优化CAP与4-Vpy摩尔反应比例及交联剂，同时以计算结果为指导，采用沉淀聚合法合成CAP-MIPs，并对CAP-MIPs的吸附性等性能进行了研究与表征。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器 CAP(标准品，上海阿拉丁试剂有限公司)；4-Vpy(化学纯，阿法埃莎化学有限公司)；EGDMA、PETA、TRIM(分析纯，上海阿拉丁试剂有限公司)；偶氮二异丁腈(ABIN)、乙腈(分析纯，天津市光复科技发展有限公司)，甲醇、乙酸(分析纯，北京化工)。

DZF-6062真空干燥箱(上海恒科仪器有限公司)；TU-1950双光速紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；KQ5200DE超声波清洗仪(昆山超生仪器有限公司)，SHZ-B水浴恒温振荡器(上海博迅实业有限公司)，TDL-60B台式离心机(上海安亭科技仪器厂)。

1.2 理论计算部分 借助Gaussian 09软件[11]构建CAP分子模型，分别使用B3LYP，LC-WPBE，PBE1PBE和ωB97XD四种DFT方法优化CAP印迹分子，收敛采用默认值。选取最接近实验值的理论方法作为本研究的计算方法。采用自洽反应场中的Tomasi极化连续介质模型模拟CAP与4-Vpy、CAP与交联剂、4-Vpy与交联剂间的相互作用。计算结合能时，基组迭加误差(Basis set superposition error，BSSE)采用Counterpoise(CP)方法消除[12]，印迹分子CAP与交联剂摩尔比例为1∶1时，结合能(ΔE)计算公式如下：

ΔE=EC-ET-ECL

(1)

式中，EC为CP方法校正后印迹分子CAP与交联剂形成复合物的总能量；ET为印迹分子CAP的能量；ECL为交联剂的能量。

功能单体4-Vpy与交联剂摩尔比例为1∶1时，结合能计算公式如下：

ΔE=EC-EF-ECL

(2)

式中，EC为CP方法校正后功能单体4-Vpy与交联剂形成复合物的总能量；EF为功能单体4-Vpy的能量；ECL为交联剂的能量。

1.3 氯霉素分子印迹聚合物与非印迹聚合物的制备 称0.1 mmol CAP(0.0323g)溶于60 mL乙腈中，按一定摩尔比加入4-Vpy，超声溶解后静置24 h；加入交联剂与引发剂，超声30 min，通入氮气5 min，除去体系中的氧气；密封后，放入SHA-C恒温水浴锅中于60 ℃热聚合24 h，将聚合物放于真空干燥箱中干燥24 h得到白色的聚合物沉淀；用冰乙酸/甲醇(1∶9，V/V)溶液于索氏提取器中洗脱印迹分子CAP，在用甲醇溶液洗脱至上清液中检不出CAP为止；蒸干至恒重，得到CAP-MIPs微球。NIPs的制备不加CAP外，其余步骤同上。

1.4 聚合物的吸附性实验 准确称取20.0 mg的CAP-MIPs(NIPs)于50 mL锥形瓶中，加入100mg/L CAP甲醇溶液10 mL，超声后放入振荡器中室温24 h，取上清液离心后用0.22微米的滤头过滤，稀释至一定浓度，用紫外分光光度计测量溶液吸光度，根据吸附前后浓度变化计算CAP-MIPs的吸附量Q(mg/g)：

Q=(C0-C)V/W

(3)

式中，其中Q为聚合物对CAP的吸附量(mg/g)，C0和C分别为CAP吸附前后的浓度(mg/L)，V为CAP甲醇溶液体积(ml)，W为CAP-MIPs(或NIPs)的质量(mg)。

1.5 扫描电镜(SEM) 取少量的CAP-MIPs或NIPs悬浮液，用甲醇稀释后超声，使CAP-MIPs或NIPs微球分散均匀，取少量混合液均匀涂抹到硅片上自然晾干，喷金，采用JSM-5600扫描电镜观测CAP-MIPs与NIPs的粒径大小及形貌。

2 结果与讨论

2.1 计算方法 表1列出了B3LYP、LC-WPBE、PBEIPBE和ωB97XD四种DFT方法对CAP分子(图1)几何结构的优化数据。由表1可知，四种方法计算所得的理论结构数据与实验晶体数据相差不大，且均在误差允许范围内，说明DFT在几何结构优化计算方面具有优势。由表1还可知，与其他三种方法相比，ωB97XD[13]方法计算得到的CAP结构参数更接近其实验值[14]。如C20-O7其键长实验值为0.1442 nm，B3LYP、LC-WPBE、PBEIPBE和ωB97XD方法理论键长为0.1431、0.1418、0.1419、0.1434 nm，与实验值的偏差为0.0011、0.0024、0.0023、0.0008 nm。C19-C18-O6其键角实验值为119.94°，四种方法与实验值偏差分别为1.60°、0.88°、1.39°、0.70°，显然，相比于其他三种方法，ωB97XD方法优化计算得到的键长与键角参数与晶体数据值更接近。因此研究选取ωB97XD/6-31G(d,p)方法优化CAP、4-Vpy及其复合物几何构型。

图1 氯霉素的分子结构式Fig 1 Molecular structure of CAP

2.2 印迹分子与功能单体反应活性位点的确定 采用ωB97XD/6-31G(d,p)方法模拟计算印迹分子CAP与功能单体4-Vpy的几何构型并计算原子的自然键轨道电荷(Natural bond orbital，NBO)，预测其印迹作用活性位点，结果见图2。由图2可知：从NBO电荷布局分析来看，CAP负电荷较多的原子主要是对硝基苯基、丙二醇、二氯乙酰胺基上的O原子与N原子，分别为O3、O4、O5、O6、O7、N9；正电荷较多的原子主要是丙二醇、二氯乙酰胺基上的H原子，如H21、H22、H23、H29。考虑与CAP印迹分子活性作用位点相互作用的主要是4-Vpy上的吡啶基，功能单体4-Vpy主要活性作用位点为H6、H9、N10。

表1 采用B3LYP，LC-WPBE，PBEIPBE 和 ωB97XD方法计算CAP的结构参数和实验值Tab 1 Bond angles of CAP calculated at the B3LYP, LC-WPBE, PBEIPBE and ωB97XD levels and available experimental data

图2 CAP(A)与4-Vpy(B)的NBO电荷分布Fig 2 NBO chanrges of CAP (A) and 4-Vpy(B)

2.3 CAP-MIPs 复合物印迹反应摩尔比例的优化 印迹分子CAP与功能单体4-Vpy反应比例合适时，相互作用较强，这种较强的相互作用可使制备的CAP-MIPs具有更好的稳定性与特异识别性。以NBO电荷布局为依据，借助Gaussian 09软件构建分子模型模拟印迹分子CAP与功能单体4-Vpy在不同印迹摩尔反应比例下的复合物稳定构型及其氢键键合数据见图3。计算模拟以相互作用位点越多，复合物越稳定的原则，选取最稳定的复合物构型作为研究对象。

从图3可以看出，随着CAP与4-Vpy摩尔反应比例增加，分子间作用位点氢键数目也在增加，即反应比例为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4时，CAP与4-Vpy复合物氢键数目分别为2、5、7、9。这说明随着印迹分子与功能单体的摩尔反应比例增大，稳定复合物中氢键数目增多，相互作用增强，形成的复合物也更稳定。当反应比例增加至1∶5时，功能单体间的相互作用，阻碍了印迹分子与功能单体间氢键的相互作用，最终导致反应比例为1∶5时的复合物氢键作用点低于1∶4，稳定性亦随之降低。因此，反应比例为1∶4时的印迹分子与功能单体形成的复合物，见图3(D)。稳定性最好，所有键的键长均在氢键范畴之内[15-16]。

图3 CAP与4-Vpy在不同摩尔反应比例下的复合物构型Fig 3 The complex configurations of CAP and 4-Vpy at different molar ratios

表2 CAP与4-Vpy在不同摩尔反应比例下结合能(ΔE)(kJ/mol)Tab 2 the Binding energies (ΔE) of CAP and 4-Vpy in different imprinted molar ratio (kJ/mol)

2.4 交联剂的优化 MIPs制备过程中，交联剂的作用是使印迹分子与功能单体聚合形成高度交联、刚性的聚合物。交联剂控制着聚合物的形态以及聚合物的物理化学性质，同时影响聚合物的识别性能。为了使制备的MIPs既具有一定的刚性以维持孔穴，又有一定的柔韧性以便与印迹分子再结合，所选的交联剂与印迹分子的结合能应高于其与功能单体的结合能。EGDMA、PETA、TRIM三种交联剂与印迹分子CAP、功能单体4-Vpy的结合能见图4。由图4可知，所有的交联剂与印迹分子CAP的结合能不仅都高于其与功能单体4-Vpy的结合能，且高于印迹分子与功能单体的结合能-58.26 kJ/mol(表2)，说明三种交联剂均适合作为CAP-MIPs的交联剂。但是由于PETA与印迹分子CAP结合能最高，与功能单体4-Vpy的结合能最低。因此，PETA更适合作为CAP-MIPs的交联剂。

2.5 聚合物的吸附性 在333 K乙腈溶剂中，分别以EGDMA、PETA及TRIM为交联剂制备CAP与4-Vpy最佳印迹摩尔比例(1∶4)MIPs与NIPs，并测定其吸附性。由图5可知，以PETA为交联剂制备的CAP-MIPs对CAP的平衡吸附量最高，其次为TRIM、EGDMA。这说明PETA比其它交联剂更适合制备CAP-MIPs，也说明了适合的交联剂有助提高CAP-MIPs的印迹效果。同时，该实验结果与上述理论计算结果一致，再一次证明理论计算的准确性。

在333 K乙腈溶剂中，以PETA为交联剂制备CAP与4-Vpy在1∶1～1∶5摩尔反应比例下的MIPs和NIPs，并测其吸附性。由图6可知，随着印迹摩尔比例的递增，聚合物的平衡吸附量在逐渐增加。当反应比例为1∶5时，其吸附性略有降低。这说明CAP与4-Vpy的最佳反应比例为1∶4，与上述计算结果一致。此外，从图中还可以看出所有对应反应比例下MIPs的平衡吸附量明显高于NIPs，说明印迹微球存在与CAP分子空间结构相互匹配的孔穴，对底物的选择识别起了关键作用。

为探讨以4-Vpy为功能单体制备的CAP-MIPs和NIPs微球形貌、粒径大小与分布范围，采用扫描电子显微镜对其进行了表征(图7)。由图7可知在333 K乙腈溶剂中制备的CAP-MIPs和NIPs形态比较均一，都近似球状，且分散性良好。借助Nano Measurer 1.2软件对聚合物微球进行粒径分布分析，结果表明CAP-MIPs与NIPs粒径分别在180～370 nm(平均粒径285 nm)与130～350 nm(平均粒径224 nm)范围内，CAP-MIPs的粒径略大，这可能是由于CAP-MIPs中模板分子的存在占有一定的空间体积，从而表现为粒径更大。

在最佳实验条件下，采用Scatchard方程进一步研究了以4-Vpy为功能单体，PETA为交联剂制备的CAP-MIPs的吸附性能。Scatchard公式如下：

图4 CAP和交联剂(CL)与4-Vpy和交联剂(CL)的结合能(ΔE)Fig 4 Binding energies (ΔEB) of CAP and cross-linking agents(CL) as well as 4-Vpy and cross-linking agents(CL)

图5 不同交联剂制备的CAP-MIPs与NIPs的吸附量Fig 5 Equilibrium adsorption amount of MIPs and NIPs synthesized with different cross-linking agents

图6 不同摩尔反应比例下的CAP-MIPs与NIPs的吸附量Fig 6 Equilibrium adsorption amount of CAP-MIPs and NIPs in different molar rations

图7 CAP-MIPs与NIPs的扫描电镜与粒径分布图Fig 7 SEM photographs and particle size distributions of CAP-MIPs and NIPs

式中，Q是平衡时吸附到聚合物上的CAP的量(mg/g)；[CAP]是平衡时溶液中剩余的CAP的浓度(mg/L)；Kd是解离常数(mg/L)；Qmax是聚合物的最大表观吸附量(mg/g)。

以Q/C对Q作图，得到一条线性相关的Scatchard直线，见图8。由图8知：

Q/C=0.0621-8.3955×10-4Q(5)

由直线斜率与截距求得：CAP-MIPs的解离常数(Kd)和最大表观吸附量(Qmax)分别为1191 mg/L和73.97 mg/g。

图8 CAP-MIPs的Scatchard曲线Fig 8 Scatchard plot of CAP-MIPs

3 结 论

采用DFT的ωB97XD/6-31G(d,p)方法模拟研究了CAP印迹分子与4-Vpy功能单体复合物的构型及印迹作用机理，优化了摩尔反应比例和交联剂。理论与实验结果均表明：CAP与4-Vpy的最佳摩尔反应比例为1∶4，以PETA作为交联剂制备的CAP-MIPs具有相对较大的吸附量。Scatchard分析方程表明：在最佳印迹条件下制备的CAP-MIPs对CAP表现出较高的吸附能力，最大表观吸附量为73.97 mg/g。本研究为CAP-MIPs应用于复杂基质食品中CAP残留的分离和检测提供了一定的理论与实验数据。

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