QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定蜂蜜中21种磺胺类药物残留

容裕棠，张宪臣，张朋杰，李蓉，黄伟蓉，陈丽斯

(广东出入境检验检疫局 检验检疫技术中心中山分中心，广东 中山，528403)

磺胺类药物(sulfonamides,SAs)是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，用于养蜂行业中可以防治蜂病、降低蜜蜂死亡率、提高蜜蜂生产性能，但是由于其在蜜蜂体内代谢降解缓慢，如果不遵守休药期规定、超量使用，易造成蜂产品中磺胺类药物残留[1-2]。如果人体长期摄入含其的蜂蜜产品，当积累到一定程度后，会对身体造成损伤[3-5]。大多数国家对磺胺类药物进行了最大残留量的规定。国际食品法典委员会(CAS)和欧盟等规定食品中的磺胺总量及单个磺胺的含量不能超过100 μg/kg。日本规定了更为严格的限量标准，如磺胺喹恶啉为50 μg/kg、磺胺甲基嘧啶为20 μg/kg、磺胺二甲嘧啶为10 μg/kg等。我国农业部235号文件《动物性食品中兽药残留的最高残留量》中规定牛、羊奶及蜂蜜中磺胺类最大残留量(MRL)为100 μg/kg。国家质量监督检验检疫总局对动物源性食品中磺胺类药物残留的重点监控项目主要包括：磺胺嘧啶、磺胺邻二甲嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺甲恶唑、磺胺氯哒嗪、甲氧苄啶等。

目前，国内外对磺胺类药物残留检测主要有：酶联免疫法[6]、气相色谱法[7-8]、高效液相色谱法[9-10]、液相-串联质谱法[11-19]等。液相色谱串联质谱法采用保留时间与特征离子对比例对已知目标物进行定性和定量分析,准确性和灵敏度优势明显，近年来已成为流行的检测方法并被广泛应用，当前多药物残留的高通量检测也集中在此法。QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，RuggedandSafe)是基于分散固相萃取发展起来的一种集萃取和净化为一体的新型前处理方法[20-21]，能够有效地缩短前处理时间，提高检测效率，已在农药残留检测、临床医学、兽药及医药残留等领域中广泛应用[22-24]。本研究利用QuEChERS前处理方法对蜂蜜中磺胺类药物残留进行净化处理，超高效液相色谱法-质谱联用法(UPLC-MS/MS)进行测定，建立蜂蜜中21种磺胺类药物的检测方法。

1 材料与方法

1.1 试剂

乙酸乙酯(色谱纯)；甲醇(色谱纯)；甲酸(色谱纯)；二氯甲烷(分析纯)；H3PO4(分析纯)；柠檬酸(分析纯)；Na2HPO4(分析纯)；NaCl(分析纯)；无水Na2SO4(分析纯)；超纯水(Millipore Milli-Q)；Mcllvaine缓冲溶液：1 000 mL 0.1 mol/L柠檬酸溶液与625 mL 0.1 mol/L Na2HPO4溶液混合。

吸附剂：C18、PSA、NH2(分析纯,上海安谱)。

21种磺胺标准品：甲氧苄啶CAS:738-70-5(trimethoprim，TMP)、磺胺二甲异嘧啶CAS:515-64-0(sulfisomidine，SIM)、磺胺嘧啶CAS:68-35-9(sulfadiazine，SDZ)、磺胺噻唑CAS:72-14-0(sulfathiazole，STZ)、磺胺吡啶CAS:144-83-2(sulfapyridine，SPD)、磺胺甲基嘧啶CAS:127-79-7(sulfamerazine，SMR)、磺胺甲氧嗪CAS:80-35-3(sulfamethoxypyridazine，SMP)、磺胺甲二唑CAS:144-82-1(sulfamethizole，SMT)、磺胺二甲嘧啶CAS:57-68-1(sulfadimidine，SDM)、磺胺对甲氧嘧啶CAS:651-06-9(sulfamethoxydiazine，SMD)、磺胺氯达嗪CAS:80-32-0(sulfachlorpyridazine,SCP)、磺胺甲恶唑CAS:723-46-6(sulfamethoxazole,SMZ)、磺胺间甲氧嘧啶CAS:1220-83-3(sulfamonomethoxine,SMM)、磺胺邻二甲氧嘧啶CAS:2447-57-6(sulfadoxine,SDX)、磺胺异恶唑CAS:127-69-5(sulfafurazole,SFZ)、磺胺恶唑CAS:729-99-7(sulfamoxole,SMO)、磺胺苯酰CAS:127-71-9(sulfabenzamide,SBA)、磺胺苯吡唑CAS:526-08-9(sulfaphenazole，SPA)、磺胺间二甲氧嘧啶CAS:122-11-2(sulfadimethoxine,SDT)、磺胺喹恶啉CAS:59-40-5(sulfaquinoxaline,SQX)，磺胺硝苯CAS:122-16-7 (sulfanitran,SAN)，纯度均大于等于99%(德国，Dr.Ehrensorfer)。

6种内标标准品：磺胺二甲嘧啶-D4(CAS:1020719-82-7)，磺胺喹噁啉-13C6(CAS:1202864-52-5)，磺胺间甲氧嘧啶-D4，磺胺邻二甲氧嘧啶-D3，甲氧苄啶-D3(CAS:1189923-38-3)，磺胺嘧啶-D4(CAS:1020719-78-1)纯度均大于等于98%(德国，Dr.Ehrensorfer)。

1.2 标准溶液配制

分别准确称取21种磺胺类药物标准品约10.0 mg，于各自的100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，制成质量浓度为0.1 mg/mL的标准储备液，置于-18 ℃冰箱中避光保存，有效期3个月。

混合标准工作液：分别准确吸取甲氧苄啶标准储备液50 μL和其余20种磺胺类药物标准储备液100 μL至100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度配成各磺胺类药物相应质量浓度为0.1 μg/mL(甲氧苄啶为0.05 μg/mL)混合标准工作液，有效期3个月。

1.3 仪器与设备

Ekspert ultraLC 100型超高效液相色谱仪、AB Sciex Triple Quad 5500质谱仪[配有电喷雾(ESI)源]美国，AB Sciex；高速离心机，美国，Thermo；VORTEX-3涡旋振荡器，德国，IKA；TurboVap氮吹浓缩仪，瑞典，Biotage。

1.4 分析条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Waters Atlantis T3,3 μm,2.1 mm×150 mm；柱温：40 ℃；进样量：10 μL；流动相：A为0.02%甲酸水溶液，B为甲醇，梯度洗脱程序：0～7 min,75% A；7～9 min，35% A；9～9.1 min，75% A；9.1～15 min，75% A。流速：0.3 mL/min。

1.4.2 质谱条件

离子化模式：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；喷雾电压：5 500 V；鞘气压力：35 L/mim；辅助气流量：6 L/min;离子传输管温度：475 ℃；扫描模式：多重反应监测(MRM)。

其他条件见表1。

表1 测定21种磺胺类药物的串联质谱参数Table 1 MS/MS parameters of 21 sulfonamides

续表1

注：*为定量碎片离子。

1.5 样品处理

准确称取蜂蜜试样1 g(精确至0.01 g)至50 mL具塞离心管中，加入混合内标工作溶液20 μL(1 μg/mL)后再加入5 mL Mcllvaine缓冲溶液(pH=4)，涡旋混合2 min使试样完全溶解。加入20 mL 1 %甲酸乙腈提取，涡旋混合2 min后依次加入1 g NaCl和3 g Na2SO4，涡旋振荡2 min，以15 ℃ 5 000 r/min离心10 min。取10 mL上清液于15 mL具塞离心管中，加入200 mg NH2吸附剂，涡旋振荡2 min，以上述相同条件离心10 min后取5 mL上清液至10 mL玻璃管中，于50 ℃氮吹浓缩仪吹干。准确加入1 mL[乙腈+0.02%甲酸水溶液(体积比1∶9)]溶解残渣，过0.22 μm有机相滤膜后，供超高效液相色谱-串联质谱仪测定。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法优化

2.1.1 不同稀释液对磺胺类药物的影响

针对蜂蜜基质，如预先不加入水相进行预溶，则难溶于后续萃取过程中的有机溶剂(如乙腈、乙酸乙酯等)，因此通常加入水或适当的缓冲盐溶液进行稀释，使其形成均相体系，便于磺胺类药物的提取。本文选择阴性蜂蜜样品为实验材料，添加浓度为10 μg/kg的混合标准品溶液，每个样品3平行对稀释液进行优化。实验对比了水、质量分数1% H3PO4和Mcllvaine缓冲溶液3种稀释溶液。由于蜂蜜基质中含有大量水分，磺胺类药物在稳定的弱酸性缓冲盐体系下能更好得溶解出来，结果表明，采用Mcllvaine缓冲溶液稀释后的蜂蜜样品对各类磺胺药物残留的回收率最为理想，见图1。

图1 不同稀释液的21种磺胺类回收率
Fig.1 The recovery rate of 21 sulfonamide in different diluents

2.1.2 不同萃取溶剂对磺胺类药物的影响

样品经缓冲溶液稀释溶解后，选择阴性蜂蜜样品为实验材料，添加浓度为10 μg/kg的混合标准品溶液，每个样品3平行对萃取溶剂进行优化。由于磺胺类药物易溶于极性有机溶剂，分别考察了乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷3种萃取溶剂：乙酸乙酯和二氯甲烷对蜂蜜等复杂样品有较大的基质增强效应，在色谱图上表现为噪音过大，对各类磺胺分离效果不佳(见图2)，且选取乙腈作为萃取溶剂时回收率较其他两者高，大部分目标物回收率为80%～110%。

图2 乙酸乙酯的萃取效果色谱图
Fig.2 Extraction chromatogram of ethyl acetate

另外从磺胺类药物的分子结构上考虑，由于基团上有呈弱酸性磺酰胺基，在乙腈中加入适当的酸性溶液有助于更好地提取和电离，且酸化乙腈能更好得使蜂蜜中蛋白质沉淀，因此本文选取1%甲酸乙腈作为萃取溶剂，3种萃取溶剂对各类磺胺的平均回收率见图3。

图3 不同萃取溶剂对21种磺胺回收率
Fig.3 The recovery rate of 21 sulfonamide in different solvernts

2.1.3 不同分散固相吸附剂对磺胺类药物的影响

传统的磺胺类药物的净化方法一般采用正己烷或者固相萃取小柱，但由于蜂蜜基质成分复杂，基质干扰大，正己烷净化只能去酯，而采用固相萃取小柱净化效果较好但其成本高、操作复杂、耗时，不适用于大批量样品同时检测，本文采用分散固相吸附剂进行净化，选择阴性蜂蜜样品为实验材料，添加浓度为10 μg/kg的混合标准品溶液，每个样品3平行对分散固相吸附剂进行优化，分别考察了C18、PSA、GCB和NH2这几种目前较为常用的吸附剂：GCB主要用于去除叶绿素、类胡萝卜素等色素化合物，但蜂蜜中不含有叶绿素、类胡萝卜素等物质，因此不加入GCB。C18主要吸附非极性化合物(如脂肪)，但对蜂蜜中糖类共提物吸附效果有限；PSA可以吸附多种色素、糖、和脂肪酸，但相比于NH2对磺胺类药物吸附后的回收率低；采用NH2作为分散固相吸附剂时，各类磺胺类药物残留在基质中响应最理想，不同吸附剂对各类磺胺平均回收率的效果见图4。

图4 不同吸附剂对21种磺胺的回收率
Fig.4 The recovery rate of 21 sulfonamide in different adsorbents

2.1.4 吸附剂的用量对磺胺类药物的影响

选择阴性蜂蜜样品为实验材料，添加浓度为10 μg/kg的混合标准品溶液，每个样品3平行对吸附剂用量进行优化，分别比较了3种吸附剂用量(100、200、300 mg)对各类磺胺回收率影响。试验表明，使用100 mg时，由于用量小，去除糖、有机酸、脂肪酸等杂质的效果有限，回收率稍低；增加用量至300 mg时，可能由于吸附剂过多导致额外吸附目标化合物，回收率不增反减，因此选取200 mg作为吸附剂用量，不同吸附剂用量对各类磺胺回收率的影响见图5。

图5 不同吸附剂用量对各类磺胺的回收率
Fig.5 The recovery rate of 21 sulfonamide in different dosage of adsorbent

2.1.5 盐析剂和吸水剂对磺胺类药物的影响

在提取过程中，向蜂蜜样品溶液中加入无机盐既可以改变待测组分的提取效率，又有利于水相和有机相间的分层。实验选用目前较为常用的盐析剂NaCl，吸水剂无水Na2SO4。试验中选择阴性蜂蜜样品为实验材料，添加浓度为10 μg/kg的混合标准品溶液，每个样品3平行对盐析剂和吸水剂的用量进行优化。试验表明，加入1 g NaCl、3 g无水Na2SQ4时，各磺胺类药物回收率最理想(见图6)，这是由于适量的NaCl和无水Na2SQ4能有效吸收多余水分、增加离子强度，从而使目标化合物更容易从水相进入有机相。

图6 不同盐析剂和吸水剂用量对21磺胺类药物回收率
Fig.6 The recovery rate of 21 sulfonamide in different dosage of salting-out agent and SAP

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱的选择

磺胺类药物都是以对位氨基苯磺酰胺为基本结构的衍生物，属于极性较强的化合物，本文选择对极性较强的化合物分离较好的3款色谱柱：Atlantis T3 C18(3 μm,2.1 mm×150 mm)、RESTEK ultra AQ C18(100 mm×2.1 mm, 3.0 μm)、Thermo Hypersil GOLD C18(3 μm,2.1 mm×100 mm)对21种磺胺类药物进行分离。Thermo Hypersil GOLD(1.9 μm,2.1 mm×60 mm)对21种磺胺类药物分离效果不佳；Thermo Hypersil GOLD C18(3 μm,2.1 mm×100 mm)这款色谱柱稳定性差，无法保留磺胺甲氧达嗪(SMP)、磺胺对甲氧嘧啶(SMD)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)这3种磺胺类药物、无法从基线上分离这3者(见图7)。Atlantis T3 C18(3 μm,2.1 mm×150 mm)色谱柱对21种磺胺类药物均有较好的保留，稳定性高，满足试验要求，因此选取此款色谱柱进行分析。

图7 Thermo Hypersil GOLD C18(3 μm,2.1 mm×100 mm)
对磺胺甲氧达嗪(SMP)、磺胺对甲氧嘧啶(SMD)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)分离效果
Fig.7 Separating effect of SMP，SMD，SMM by thermo hypersil GOLD C18(3 μm,2.1 mm×100 mm)

2.2.2 流动相的选择

为同时使21种磺胺类药物残留均达到满意的分离度，选取了甲醇-0.02%甲酸水溶液、乙腈-0.02%甲酸水溶液、甲醇-水和乙腈-水4种不同的流动相进行对比，试验结果表明：以甲醇-0.02%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱时，低浓度的甲酸水溶液能使21种磺胺类药物较好得分离，各类磺胺类药物的响应显著增加，化合物峰形尖锐，原因可能在于低浓度的甲酸水溶液能提供适当的质子，从而在离子源打碎目标物时能提高离子化程度，而甲醇相较于乙腈的洗脱能力弱，能更好得将21种磺胺类药物进行有效分离，混合标准品离子流图见图8。

图8 21种磺胺类药物标准品离子色谱图(各类磺胺质量浓度为2 ng/mL)
Fig.8 Standard ion chromatogram of 21 sulfonamide

2.3 质谱条件的优化

碱性磺胺类化合物选取电喷雾离子源正离子模式进行分析，将21种磺胺类药物的标准溶液稀释至1 μg/mL进样，选择定量母离子扫描方式(Q1)确定各分子离子，然后对其子离子进行二级全扫描(Q2),确认21种磺胺类药物的离子对，优化碰撞能量、鞘气、辅助气等参数,同时使21种磺胺类药物分子离子与特征离子碎片的离子对强度比例较大且稳定时，得到适用于磺胺类的最佳质谱条件,各化合物质谱检测参数见表2。

2.4 线性范围与检出限

称取空白蜂蜜样品，分别精确加入混合标准工作液和同位素内标标准液，在选定的色谱和质谱条件下测定，以信噪比(S/N)3为最低检出限(LOD)，信噪比(S/N)10为定量检出限(LOQ)，各化合物的回归方程、线性范围、相关系数和检出限(LOD、LOQ)见表2。试验结果表明，21种磺胺在0.05～60 ng/mL内具有良好线性，相关系数均大于0.99。

2.5 方法的回收率、精密度

称取空白蜂蜜样品1 g(精确至0.01 g)，选取低、中、高3个合适浓度分别添加标准溶液(具体见表3)，每个加标水平平行6次，从空白样品与添加样品的谱图看，内标和被测物的绝对基质效应接近(见图9)，试验结果表明，3个浓度的加标回收率在60.44%～107.80%间，相对标准偏差RSD为1.21%～8.93%，满足试验要求。

图9 空白样品(a)、加标样品(b)和内标样品(c)的基质效应比较
Fig.9 Comparison of matrix effects of blank sample(a)、standard-added sample(b) and internal standard-added sample(c)

表3 方法的回收率和相对标准偏差Table 3 Recoveries and RSD of the method

续表3

3 小结

本文建立了蜂蜜中21种磺胺类药物残留的QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱的测定方法，方法灵敏，准确，省时，稳定，实用性强，试验表明：该法检出限在0.12～2.46 μg/kg，定量限在0.40～8.19 μg/kg，回收率在60.44%～107.80%，相对标准偏差为1.21%～8.93%，方法学结果满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范》的技术要求，适用于食品实验室大量蜂蜜样品的快速检测。