苗药乌蕨提取物抗炎作用及其机制研究

陈 明 王 恒 赵鸿宾 余跃生 段 萍

(1.黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558000； 2. 黔南州食品药品检验所，贵州 都匀 558000)

乌蕨(Stenoloma chusanum (L)Ching)系鳞始蕨科乌蕨属植物,广泛分布于我国长江以南许多省份[1]，为贵州省苗族习用药材，苗语称其为空麻昌、豆麻昌[2][3]。该药主要以野生为主，资源十分丰富，也可进行人工种植。民间长期用其治疗外伤感染。据文献报道,该药的化学成分包括黄酮类、酚类、挥发油、甾体和多糖等[4][5]，有明显的抗菌活性,能用于多种炎症的治疗[6]，但目前还没有关于该药抗炎作用机制方面的研究报导，对其药理作用的研究也不够全面、深入。本研究旨在验证乌蕨提取物的抗炎作用，并探究其作用机制，在比较常用抗炎药物阿司匹林与乌蕨提取物的抗炎作用后，我们可以初步肯定苗药乌蕨在抗炎方面的临床应用价值。

1 材料

1.1 动物 选用昆明种小鼠100只，标准为：健康，体质量在18～22g范围内，雌雄各半。由贵州医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(黔)2012-0001。

1.2 药材与试剂 乌蕨原植物采自贵州省都匀市马鞍山林区，经黔南民族医学高等专科学校中药教研室魏学军教授鉴定为鳞始蕨科乌蕨属植物(Stenoloma chusanum (L)Ching)。二甲苯、阿司匹林购自国药集团化学试剂公司；伊文斯蓝，批号：DJ1405WL；环氧化酶(COX-2)，批号：201508；前列腺素(PGE2)，批号：201508；肿瘤坏死因子α(TNF-α)，批号：201508；一氧化氮(NO)，批号：201508；试剂盒购自北京鼎国昌盛生物科技有限责任公司(From Sigma)。其余试剂均为市售分析纯。

1.3 仪器和设备 酶标仪，芬兰Lab-systems公司；TDL-4ZB型台式低速离心机，湖南星科科学仪器厂；BS223型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；Agilent Cary 100型分光光度计,美国安捷伦公司。

2 方法

2.1 乌蕨提取物的制备 取干燥的乌蕨药材(地上部分)粉碎过筛，称取1000g，用15倍量65%乙醇，80℃水浴回流提取3次，1h/次，合并提取液，减压浓缩至无醇味，转移至分液漏斗中，加石油醚萃取5次，将母液减压蒸发除去石油醚，然后加入等体积乙酸乙酯，萃取4～6次，合并乙酸乙酯萃取液，将其减压浓缩，回收乙酸乙酯，得到乙酸乙酯萃取物，减压干燥；称取干燥的乙酸乙酯萃取物适量，加少量水溶解，加适量吐温80，配制成以浸膏计浓度为4.42mg.mL-1溶液,供实验使用。

2.2 阿司匹林对照液的制备 取阿司匹林0.5011g，置100mL量瓶中，加纯化水适量溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 乌厥提取物对小鼠耳廓肿胀的影响[7]取健康昆明种小鼠50只，按体重随机分为5组，每组10只，雌雄各半。具体分组情况如下：阿司匹林对照组(100mg·kg-1)、乌蕨提取物低剂量组(22.1mg·kg-1)、乌蕨提取物中剂量组(44.2mg·kg-1)、乌蕨提取物高剂量组(88.4mg·kg-1)、正常对照组(生理盐水20mL·kg-1)。连续给药7d，每天ig给药1次。在最后一次给药后1h，将小鼠右耳耳廓均匀涂抹二甲苯(0.05mL/只，正、反面均需涂抹)致炎，左耳不涂作为对照，30min后摘除眼球，取血保存备用。随即采用颈椎脱臼法将小鼠处死，使用打孔器在小鼠左、右耳廓相同部位打下直径9mm圆耳片，立即准确称取耳片质量。右耳与左耳重量之差即为肿胀度。肿胀抑制率计算方法如下：

肿胀抑制率(%)=

2.4 乌厥提取物对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响[8]：冰乙酸的主要作用是增加小鼠腹腔毛细血管通透性，使静脉内的伊文思蓝渗出，测定腹腔洗液的OD值可反映毛细血管通透情况。

按前文2.3方法进行分组及给药。最后一次给药1h后，采用尾静脉注射法注射1%伊文斯蓝(20mL·kg-1)，随后腹腔注射0.7%冰乙酸(20mL·kg-1)，间隔30min后摘除小鼠眼球，取血，保存备用。完成上述操作后，立即采用颈椎脱臼法处死小鼠，剪开腹腔将6mL生理盐水注入腹腔内，进行腹腔充分清洗，吸出腹腔洗液，离心10min(1500rpm)。取离心后的上清液在590nm处测定吸光度(OD值)。

2.5 血清制备及指标分析 各小鼠血液静置30min后，3000rpm，离心半径为5cm，离心15min，取血清。按检测要求分装，置冰箱保存(-20℃)备用。根据COX-2、PGE2、TNF-α、NO说明书测定并计算。

3 结果

3.1 乌蕨提取物对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响 小鼠右耳涂抹二甲苯后，耳肿胀明显。阿司匹林对照组和乌蕨提取物中剂量组对二甲苯致小鼠耳肿胀有明显的抑制作用，与正常对照组比较差异显著(P<0.05)。实验结果见表1。

表1 乌蕨提取物对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀度的影响

注：与对照组比较1)P<0.05,2)P<0.01

本研究结果显示，阿司匹林组及乌蕨提取物中剂量组能够极显著的降低COX-2、PGE2、TNF-α、NO水平(P<0.01)；乌蕨提取物高剂量组能够显著降低COX-2和TNF-α水平(P<0.05或P<0.01)。实验结果见表2。

表2 乌蕨提取物对二甲苯致耳肿胀小鼠血清COX-2、PGE2、 TNF-α、NO的影响

注：与对照组比较1)P<0.05,2)P<0.01

表3 乌蕨提取物对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

注：与对照组比较1)P<0.05,2)P<0.01

3.2 乌蕨提取物对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响：实验结果表明，阿司匹林组及乌蕨提取物各剂量组OD值与对照组比较均有显著性差异(P<0.01)。阿司匹林及乌蕨提取物均可显著抑制小鼠腹腔毛细血管通透性。见表3。

同时研究结果提示，阿司匹林组及乌蕨提取物中剂量组能够显著地降低COX-2、PGE2、TNF-α、NO水平 (P<0.05或P<0.01)；乌蕨提取物高剂量组能够显著降低COX-2和TNF-α水平(P<0.01)；乌蕨提取物低剂量组能够显著降低COX-2水平(P<0.01)。乌蕨提取物中剂量组在降低血清COX-2、PGE2、TNF-α、NO水平方面与阿司匹林相似。实验结果见表4。

4 讨论

炎症是机体对损伤因子所发生的复杂的防御反应，炎症反应时血管系统的一系列改变是其防御作用的关键，也是炎症过程的中心环节。在此过程中炎症部位的充血和渗出，有利于稀释毒素、杀伤和包围损伤因子，达到消灭致病因子的目的。与炎症反应相关的细胞因子众多,主要包括白细胞介素、趋化因子、生长因子、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子等。细胞因子具有多效性、重叠性、拮抗性、协同性等多种生理特性,参与多种生理功能调节[9-10]，其发挥作用的途径主要包括旁分泌、自分泌或内分泌等方式 。炎症反应及其相关的细胞因子对机体在产生保护作用的同时也有可能产生伤害，比如可直接或间接损伤机体的细胞和组织，严重的炎症反应还可危及生命。

表4 乌蕨提取物对腹腔毛细血管通透性实验小鼠血清COX-2、PGE2、 TNF-α、NO的影响

注：与对照组比较1)P<0.05,2)P<0.01

本实验通过二甲苯致小鼠耳肿胀模型，发现乌蕨提取物(中剂量组)对二甲苯致小鼠耳肿胀有明显的抑制作用，与正常对照组比较差异显著(P<0.05)。同时发现乌蕨提取物(中剂量组)能够极显著地降低耳肿胀模型小鼠血清COX-2、PGE2、TNF-α、NO水平(P<0.01)；乌蕨提取物(高剂量组)能够显著降低耳肿胀模型小鼠血清COX-2和TNF-α水平(P<0.05或P<0.01)。

通过冰乙酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高模型，发现乌蕨提取物各剂量组OD值与对照组比较均有显著性差异(P<0.01)。同时发现乌蕨提取物(中剂量组)能够显著地降低腹腔毛细血管通透性增高模型小鼠血清COX-2、PGE2、TNF-α、NO水平 (P<0.05或P<0.01)；乌蕨提取物(高剂量组)能够显著降低小鼠血清COX-2和TNF-α水平(P<0.01)；乌蕨提取物(低剂量组)能够显著降低小鼠血清COX-2水平(P<0.01)。

综上所述，乌蕨提取物对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀有明显抑制作用，能够显著降低小鼠腹腔毛细血管通透性。乌蕨提取物在一定剂量下能显著抑制小鼠血清中COX-2、PGE2、TNF-α、NO等炎症因子浓度，乌蕨提取物(中剂量组)在降低血清COX-2、PGE2、TNF-α、NO水平方面与阿司匹林相似。推测乌蕨提取物的作用机制可能与减少炎症因子的合成与释放有关。对于实验中发现的乌蕨提取物中剂量组抗炎作用强于高剂量组这一现象，在中草药作用机制的研究中经常出现，其原因有待进一步研究。

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[6] 岳银,杨加竹,陈业高.乌蕨的化学成分及活性研究进展[J].广州化工, 2013,4l(17):41-43.

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