蒙药蒙古山萝卜花中总黄酮的含量测定方法△

金 蓉 赛 那 苏晓丽 郭 伟 刘 畅 马月宏* 周海霞

(1.内蒙古医科大学基础医学院，内蒙古 呼和浩特 010110;2.内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010110； 3.内蒙古包头市北方重工集团医院，内蒙古 包头 014030)

蒙古山萝卜花，又称蓝盆花，别名轮锋菊，松虫草[1]，为川续断科蓝盆花(山萝卜)属植物。约100种，产于欧洲、亚洲、非洲南部和西部，主产地中海地区。我国有9种2变种，主要分布于内蒙古、黑龙江、吉林、辽宁、河北等省。《中华人民共和国卫生部药品标准》(蒙药分册)[2]中规定作为正品药用，该蒙药味甘、涩，性钝、燥、腻、重、凉，具解热、清“协日”之功效，蒙医临床用于肺热、肝热、咽喉热等，主治肝火头痛、发烧、肺热咳嗽、黄疸等病[3]；藏医多用于肺热、肝热、咽喉热等疾病的治疗。

现代药理研究表明蒙古山萝卜花植物中所含化学成分类型较多，主要有黄酮类、三萜类、环烯醚萜、香豆素类、酚类、有机酸和挥发油等结构类型[4]。药理作用有解热抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、镇静、增强免疫、抗菌、保护肾脏、减肥等功能[5]，尤其是在抗氧化和抑菌等方面效果显著[6]。主要有效成分为黄酮类和三萜类[7]。因此，我们很有必要建立一种经济、快捷的蒙古山萝卜花中总黄酮的体外含量测定方法，为进一步探究其体内药物动力学过程及作用机制研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料 蒙古山萝卜花药材购自天康蒙药有限公司，生产批号：20140418，20150729；经内蒙古医科大学药学院生药教研室及蒙医药学院蒙药炮制实验室鉴定为川断续科植物华北蓝盆花的干燥花序。芦丁对照品(中国药品生物制品鉴定所)；其余试剂均为分析纯。

TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；ZTB-B磁力搅拌电热套(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司)；AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；RE-201D旋转蒸发仪(巩义市予华仪器有限责任公司)；SHZ-CA循环水式多用真空泵(巩义市英峪仪器厂)；sigma3-18高速低温离心机。

1.2 方法

1.2.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品10.0mg，置于50mL容量瓶中，加入10%的乙醇适量，超声使溶解，再加入30%乙醇，稀释至刻度，摇匀，即得浓度为200mg·L-1芦丁对照品溶液。

1.2.2 供试品溶液的制备 将干燥蒙古山萝卜花药材粉粹后过40目筛，制成实验中所使用的蒙古山萝卜花药材粗粉。精密称定蒙古山萝卜花粗粉17g，加70%乙醇200mL，加热回流1h，抽滤，滤渣用70%乙醇洗涤，在旋转蒸发仪中浓缩至约200mL，得到的浓缩液用70%乙醇定容于250mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，备用。精密量取蒙古山萝卜花提取液1mL，置于200mL容量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

1.2.3 测定波长的选择 精密量取1.2.1项下芦丁对照品溶液1.0mL，置于25mL容量瓶中，加30%的乙醇至6.0mL，在加5%的亚硝酸钠溶液1.0mL，摇匀，放置6min；加10%的硝酸铝溶液1.0mL，摇匀，放置6min；加10%的氢氧化钠溶液10.0mL，加30%乙醇至刻度，摇匀，放置10min。以相应的试剂作空白，于分光光度计200～800nm波长范围内进行扫描。得出在509nm处有最大吸收，故选择509nm波长作为测定波长。

1.2.4 标准曲线的绘制[8]精密称取芦丁对照品10mg，加10%乙醇溶解，室温下超声10min，转入50mL容量瓶中，用30%乙醇定容即得对照品溶液。精密吸取该3.0mL，4.5mL，6.0mL，7.5mL，9.0mL，10.5mL分别置于25mL容量瓶中加30%乙醇至10.5mL，按1.2.3项下“加5%亚硝酸钠溶液1.0mL”。放置10min后，以相应试剂做空白，于509nm波长处测定吸光度。以浓度(C)与吸光度(A)进行直线回归。实验数据附图1，得到回归方程为Y=0.0076X+0.0404(R=0.9997)。

表1 标准曲线实验数据

图1标准曲线

1.2.5 精密度实验 精密量取1.2.1项下芦丁对照品溶液1.0mL，置于25mL容量瓶中，按1.2.3项下“加5%亚硝酸钠液1.0mL”。放置10min后，以相应试剂做空白，于509nm波长处测定吸光度。连续测定5次，计算精密度，结果测得吸光度的RSD为0.056%，(n=5)，表明精密度良好。

1.2.6 稳定性实验 精密量取1.2.1项下芦丁对照品溶液1.0mL于25mL容量瓶中，按1.2.3项下“加5%亚硝酸钠液1.0mL”。放置10、15、20、25、30、35、40、45、50min后，以相应试剂做空白，于509nm波长处测定吸光度。测定同一试液在不同时间的总黄酮含量，以判断试液的稳定性，结果表明，样品的吸光度在30min内保持稳定。

1.2.7 重现性实验 精确量取2mL1.2.1项下芦丁对照品溶液，5份于50mL容量瓶中，同2.1.5项下处理，以相应试剂做空白，于509nm波长处分别测定5份溶液的吸光度，计算重现性，结果测得吸光度的RSD为0.42%，(n=5)，表明重现性良好。

1.2.8 回收率实验 精确量取1.2.2中供试品溶液0.3mL，平行3份；精确量取1.2.1中芦丁对照品溶液0.5mL，平行3份，分别置于25mL容量瓶中。加30%乙醇至7.0mL，再按1.2.3项下“加入5%亚硝酸钠溶液1.0mL”，加30%乙醇至刻度，摇匀后放置10min，依法测定吸光度值，从标准曲线上读出各组浓度(mg·L-1)，计算回收率，实验数据见表2。

表2 回收率实验数据

2 含量测定

精密量取1.2.9中含测溶液0.3mL，置于25mL容量瓶中，加30%乙醇至7.0mL，再加入5%亚硝酸钠溶液1.0mL，摇匀后放置6min；再加入10%硝酸铝溶液1.0mL，摇匀后放置6min；最后加10%氢氧化钠溶液10mL，加30%乙醇至刻度，摇匀后放置10min，以相应的试剂做空白，于波长509nm处测定吸光度，计算总黄酮的含量在4.0%以上。

表3 含量测定结果

3 讨论

本实验中采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色体系，其原理是先以NaNO2还原黄酮类化合物，再加Al(NO3)3络合，最后加NaOH溶液显色，产生红色化合物进行比色测定。该显色体系具有一定的局限性，其限定测定波长为500～510nm，并且一般采用的对照品多为芦丁[9]。在实验过程中由于3种试剂加入的量不同，步骤繁琐，所以可以进一步将该显色体系的试剂加入量进行正交优化。对于提取方法的考察，参考赵子龙等对于天然植物中总黄酮的提取方法研究[10]，选用了乙醇回流提取法，加入乙醇浓度70%，提取时间1h，提取次数1次。选取2个不同批号的蒙古山萝卜花中药饮片，其中总黄酮的含量均在4%以上。

[1]国家中医药管理局中华草本编委会.中华本草·蒙药卷[M].上海：上海科学技术出版社，2004:385.

[2]中华人民共和国卫生部．中华人民共和国卫生部药品标准:蒙药分册[S]．1998: 52.

[3]麻剑南.苹果梨果皮和蓝盆花的化学成分及生物活性研究[D].呼和浩特：内蒙古大学，2015.

[4]珠日根，李福全.蒙药蓝盆花化学成分和药理作用研究进展[J].中国民族民间医药，2012：4-5.

[5]王国英，薛培凤.蒙药蓝盆花及其同属植物的研究进展[J].内蒙古医学院学报，2009,31(5)：487-490.

[6]黎田儿，欧阳辉，杨林军，等.蓝盆花属植物化学成分及药理活性研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2015，21(18)：226-230.

[7]韩丹，罗素琴，刘乐乐，等.蒙药蓝盆花有效成分的初步研究[J].内蒙古医学院学报，2009,31(3)：279-281.

[8]王国英，薛培凤，高汝燕，等.紫外可见分光光度法测定蒙药蓝盆花中总黄酮的含量[J].2010,32(2)：219-222.

[9]何珺，颜仁梁，刘志刚.NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法测定总黄酮应用中的常见问题[J].今日药学，2009,19(12)：18-20.

[10]赵子龙，薛培凤，倪佩东，等.天然药物中总黄酮的提取工艺研究进展[J].内蒙古医学院学报，2012,34(6)：512-515.