超声辅助法提取杜仲鲜叶中的车叶草苷

2018-05-10刘俊伶徐明杨学兵杨磊莫开林

四川林业科技 2018年2期

刘俊伶，徐明，杨学兵，杨磊，莫开林*

(1. 东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150040； 2. 四川省林业科学研究院，四川成都 610081)

杜仲(EucommiaulmoidesOliver)为杜仲科杜仲属多年生落叶乔木，雌雄异株，为我国特有的经济树种之一[1]。适宜生长在阳光充裕、湿润温和的地方，在我国分布广泛，主要分布在四川、云南、广西、贵州、河南和长江中下游等地[2]。

杜仲传统以树皮入药，因其资源较为匮乏，属于我国名贵的中药材，生产成本高。自然生长周期长，过度地剥皮会导致杜仲树死亡，导致杜仲树皮资源十分匮乏，远远不能满足市场需求[3]。现代研究证实，杜仲叶与其皮的药用功能大致相同，提取物中有效成分也基本上相似，杜仲种植成活后，第3年就可以采收杜仲叶，且杜仲叶产量较大，资源丰富，因此，以叶代皮，可以弥补树皮资源不足。杜仲叶在 2005 年也正式被收载于《中国药典》，所以对杜仲叶的研究和生产应用研究备受关注[4～6]。

目前，从杜仲叶和皮中现在已经分离出15 种环烯醚萜类化合物，多以糖苷的形式存在。车叶草苷是杜仲叶中的一种环烯醚萜类化合物，具有降压、降血脂、保肝利胆、抗炎、镇痛、抗衰老等药用价值[7～9]。

超声提取技术(UAE)作为一种比较先进的提取技术，相比传统的提取方法具有很多的优势和特点。如提取时间短、节约溶剂、提取率高、应用广泛等。这些优势和特点使得超声提取在中药化学成分提取方面获得了广泛应用。鉴于此，本文尝试采用超声辅助法从杜仲叶中提取车叶草苷，为杜仲叶的进一步深度利用提供技术支持[10,11]。

1 材料及仪器

杜仲鲜叶由四川省林业科学研究院提供，经东北林业大学谷会岩副教授鉴定。车叶草苷(纯度98%)、购于上海源叶生物科技有限公司，色谱级甲醇购于赛莫非世尔科技(中国)有限公司，分析纯乙醇购于天津市天士力化学试剂有限公司。

安捷伦1 260 Infinity II Prime购于安捷伦科技(中国)有限公司；KQ-200VDB三频数控超声波清洗机购于昆山超声仪器有限公司。

2 方法

2.1 原料的预处理

用碎菜机把新鲜的杜仲叶挤压成碎末，冷藏备用。

2.2 车叶草苷含量测定

标准曲线的绘制：分别配制0.2 mg·mL-1、0.3 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1的车叶草苷对照品溶液，HPLC检测，绘制标准曲线，线性拟合方程式为：

Y=8 897.1x+ 638.3，R2=0.9994

(1)

式中：x为对照品的浓度(mg·mL-1)，Y为1 mg·mL-1标准液对应的峰面积。

车叶草苷含量测定的方法如下：称取杜仲叶碎末1.2 g(折干重0.33 g)溶于5 mL 70%的乙醇中，超声提取获得提取液，冷却至室温，HPLC检测得峰面积。将峰面积代入标准曲线方程(1)得提取液中车叶草苷浓度。

杜仲叶中车叶草苷得率计算公式：

Y=vc/M×1000

(2)

式中：Y为得率(ug·g-1)；v为提取液的体积(mL)；c为提取液的浓度(mg·mL-1)；M为杜仲碎末的干重重量(mg)。

2.3 HPLC分析条件：

流动相为水(A)和甲醇(B)体系，梯度洗脱:0 min～10 min，5%～15%B；10 min ～45 min，15%～32%B；45 min～46 min，32%～60%B；46 min ～56 min，60%～60%B；56 min ～57 min，60%～5%B；57 min ～70 min，5%～5%B。

检测波长：238 nm，进样量：10 μl，柱温：30℃，流速：1 mL·min-1。

2.4 超声波辅助提取杜仲叶中的车叶草苷单因素试验

精确称取一定量碎菜机挤压所得的新鲜杜仲叶碎末，溶于乙醇水溶液(车叶草苷化合物分子量较小，具有极性官能团，偏亲水性。根据相似相容原理。提取车叶草苷应选择极性较强的溶剂，所以本实验以乙醇水溶液最为溶剂)，超声辅助提取，得到提取液，冷却至室温，0.45 μm滤膜过滤，HPLC检测。在其他条件相同的情况下，分别改变提取时间、提取功率、乙醇的浓度、液料比，以得到最佳提取方案。

(1)乙醇浓度：选择不同浓度的乙醇水溶液，精确称取1.8 g杜仲碎末(折干重0.5 g)，分别加入5 mL所选的提取溶剂，混匀，超声功率200 W提取30 min，冷却，过滤，滤液HPLC检测，代入公式，计算车叶草苷的得率。

(2)液料比：分别按照5 mL·g-1、10 mL·g-1、15 mL·g-1、20 mL·g-1、25 mL·g-1的液料比，精确称取，加入最佳浓度的乙醇水溶液，在200 W超声功率下，超声30 min，滤出上清液，HPLC检测，代入公式，计算车叶草苷的得率。

(3)超声功率和超声时间：选择最佳液料比以及乙醇浓度，依次超声10 min、20 min、30 min、40 min、50 min和60 min；选择不同的超声功率80 W、120 W、160 W和200 W，滤出上清液，HPLC检测，代入公式，计算车叶草苷的得率。

3 结果与讨论

3.1 乙醇浓度的影响

准确称取新鲜的杜仲叶碎末1.8 g(折干重0.5 g)，加入10 ml的试管中，分别加入10倍(g·ml-1)的提取溶剂 (纯水，10%乙醇，20%乙醇，30%乙醇，40%乙醇，50%乙醇，60%乙醇，70%乙醇，80%乙醇，90%乙醇)，在相同的超声条件下(超声功率200 W)超声提取30 min，测定峰面积，并计算车叶草苷的得率。

实验结果(见图1)可以看出得率随着乙醇浓度的增加而逐渐增高，当乙醇浓度达到70%时，得率至最高，但当乙醇浓度再提高时，得率却有下降的趋势。产生这种现象的原因可能是水对物料起溶胀作用。综合考虑，当乙醇浓度为70%时为最优提取浓度。